Un posible modelo de pez cebra de la enfermedad renal poliquística: Derribo de<em> Wnt5a</em> Causas Los quistes en el pez cebra Riñones
Summary
We describe a method of generating a possible zebrafish model of polycystic kidney disease. We used Tg(wt1b:GFP) fish to visualize kidney structure. Knockdown of wnt5a was by morpholino injection. Pronephric cyst formation after wnt5a knockdown was observed in this GFP transgenic zebrafish.
Abstract
Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The molecular mechanisms leading to cyst formation in PKD remain somewhat unclear, but many genes are thought to be involved. Wnt5a is a non-canonical glycoprotein that regulates a wide range of developmental processes. Wnt5a works through the planar cell polarity (PCP) pathway that regulates oriented cell division during renal tubular cell elongation. Defects of the PCP pathway have been found to cause kidney cyst formation. Our paper describes a method for developing a zebrafish cystic kidney disease model by knockdown of the wnt5a gene with wnt5a antisense morpholino (MO) oligonucleotides. Tg(wt1b:GFP) transgenic zebrafish were used to visualize kidney structure and kidney cysts following wnt5a knockdown. Two distinct antisense MOs (AUG – and splice-site) were used and both resulted in curly tail down phenotype and cyst formation after wnt5a knockdown. Injection of mouse Wnt5a mRNA, resistant to the MOs due to a difference in primary base pair structure, rescued the abnormal phenotype, demonstrating that the phenotype was not due to “off-target” effects of the morpholino. This work supports the validity of using a zebrafish model to study wnt5a function in the kidney.
Introduction
El pez cebra (Danio rerio), los embriones se han usado ampliamente como un modelo para estudiar el desarrollo del riñón y enfermedad renal poliquística. Hay muchas ventajas en el uso del pez cebra como modelo animal: la viabilidad de estudiar las interacciones genéticas, la capacidad de utilizar morfolinos antisentido (MO) durante caída de proteínas, la oportunidad para ensayar rápidamente un gran número de embriones, y la facilidad de ver fenotipos de órganos en larvas 1 viviente. Los pronefros es el primer riñón para desarrollar en los vertebrados y es funcional en larvas de pez cebra 2. La estructura de los pronefros pez cebra es relativamente simple en comparación con los metanefros de mamíferos, la tercera y última riñón a desarrollar en los mamíferos. La nefrona es la unidad de trabajo del riñón, con cada riñón humano contiene entre 500,000-1,000,000 nefronas 3,4 y cada riñón de ratón que tiene aproximadamente 13.000 nefronas 5, por lo que es difícil de observar la estructura nefrona única in riñones humanos o de ratón. El pez cebra tiene sólo dos nefronas y cada nefrona pez cebra contiene todos los componentes principales que se encuentran en el glomérulo y los túbulos de ratones y seres humanos 6 y tipos de células renales especializados similares. En comparación con otros modelos de vertebrados tales como Xenopus, la nefrona pez cebra se asemeja más a la nefrona de mamíferos, ya que tiene un sistema cerrado 7.
En los últimos años, el genoma pez cebra ha sido secuenciado, lo que permite la amplia introducción de herramientas genéticas, amplios recursos de mutantes, y colecciones de líneas transgénicas reportero en modelos de pez cebra. Las formas pronefros pez cebra entre 12 a 72 h después de la fecundación (HPF) y pueden ser visualizados fácilmente en los embriones transparentes. La proteína del tumor de Wilms WT1 es un factor esencial para el desarrollo del riñón. Líneas de pez cebra transgénicos que expresan la proteína verde fluorescente (GFP) bajo el control del promotor wt1b Tg (wt1b: GFP) mostrar expre GFPsión encuentra específicamente en las regiones pronéfricos en embriones de pez cebra, a partir de 17 HPF 8. Nefronoptisis (NPHP), una enfermedad renal quística autosómica recesiva, es causada por mutaciones de genes NPHP 9. NPHP4 desmontables por morfolino causó la formación de quistes en la Tg (wt1b: GFP). Peces 10 Por lo tanto, este pez transgénico es un modelo adecuado para la observación de las estructuras del riñón y formación de quistes durante el desarrollo del riñón. Es importante destacar que la influencia de moduladores de desarrollo del riñón puede ser estudiada usando esta cepa en un tiempo y mano de obra de manera eficiente.
Nuestro trabajo se describe el uso de Tg (wt1b: GFP) de pescado como un modelo para visualizar la formación de quistes renales después de la modulación de genes. Utilizamos inicio y empalme de sitio antisentido OM para derribar el gen Wnt5a en el pez cebra. Wnt5a es una glicoproteína secretada no canónica de la familia Wnt que juega un papel importante en el desarrollo de diversos órganos y postnatal celularfunción 11. Wnt5a trabaja a través de vías de Wnt no canónica, incluyendo la vía de la polaridad celular planar (PCP), que se ha encontrado a desempeñar un papel en la división celular orientado durante la elongación tubular renal. Wnt5a regula la vía / PCP Wnt mediante la formación de un complejo con el receptor tirosina quinasa (Ryk), que transduce más Wnt5a de señalización mediante la formación de un complejo con la proteína de la polaridad celular planar VANGL 2 (Vangl2), promoviendo así la estabilidad Vangl2 12. Los defectos en la vía de PCP pueden resultar en la división celular aleatoria y causar la formación de quiste renal. Utilizamos la Tg (wt1b: GFP) de la línea de pez cebra para observar la formación de quistes renales tras caída Wnt5a. La Tg (wt1b: GFP) modelo de pez cebra permite obtener imágenes en vivo y la observación puntual de la estructura del riñón. Después caída Wnt5a, formación de quistes renales se encontró a partir de las 24 HPF; en 72 hpf, los quistes se pueden encontrar en los glomérulos y los túbulos proximales. Este método también podría ser usado para sotros Creen genes que podrían causar la formación de quistes renales.
Protocol
Representative Results
Discussion
La enfermedad renal poliquística (PKD) es una de las principales causas de enfermedad renal terminal en los seres humanos y se caracteriza por la progresiva formación de quistes, agrandamiento renal y desarrollo de túbulos anormal 14. PKD autosómica dominante (PQRAD) es una enfermedad genética en la que la mutación de cualquiera de PKD1, que codifica policistina-1 (PC1), o PKD2, que codifica policistina-2 (PC2), los resultados en los riñones poliquísticos. Muchos otros genes, especialmente los que cod…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el NIH (DK093625 a la LH, y DK069909 y DK047757 a JHL) y la Administración de Veteranos (Premio al Mérito I01BX000820 a JHL). Nos gustaría agradecer al Dr. Michael paquete y el Dr. Jie Él en la Universidad de Pennsylvania pez cebra Core para proporcionar un apoyo esencial.
Materials
| 0.5% Phenol-Red | Sigma | P0290 | Color indicator for injection |
| Morpholino | Genn Tools, LLC | (customized) | Customized designed to the gene of interest |
| Pre-pulled needle | Tritech Research | MINJ-PP | If large amount of needle is required, you can also purchase a needle puller and prepare the needle in the lab |
| T7 mMessage Kit | Ambion | 1344 | For in vitro transcription to make capped mRNA for rescue experiment |
| N-Phenylthiourea | Sigma | P7629 | For prevention of melanization |
| Tricaine | Sigma | A5040 | Also called ethyl 3-aminobenzoate, for zebrafish anesthesia |
| Methyl Cellulose | Sigma | M-0387 | For position of zebrafish |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | For purification of PCR product for cap RNA synthesis. |
| dNTP mix | Promega | U1511 | For PCR |
| Tag DNA Polymerase | Invitrogen | 10342-053 | For PCR |
| Equipment | |||
| NanoDrop sepctrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | For measure morpholino and RNA concentration |
| Air Compressor | Werther International, Inc. | Panther Compact 106 | Air source for injection |
| Pico micro-injection pump | World Precision Instruments Inc | PV830 Pnematic PicoPump | Other types of microinjection system can be used. |
| Micro-manuplator | World Precision Instruments Inc | MMJR | Right-handed (MMJL for left handed) |
| Needle holder | World Precision Instruments Inc | 5430-ALL | To hold needle for micromanipulation |
| Dumont Tweezers | Fine Surgical Tools | 11253-20 | For breaking off the needle tip |
| Dissecting microscope | Leica M205C | For observing and imaging zebrafish embryos | |
| Fluorscence microscope | Zeiss Axio Obserer D1m | For imaging zebrafish pronephros | |
| Capillary tube (I.D 0.15 mm) | VitroCom | CV1525Q-100 | For measure the volume of each injected drop |
Referências
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