Une simple critique de taille fémorale défauts modèle chez la souris

Summary

Animal models are frequently employed to mimic serious bone injury in biomedical research. Due to their small size, establishment of stabilized bone lesions in mice are beyond the capabilities of most research groups. Herein, we describe a simple method for establishing and analyzing experimental femoral defects in mice.

Abstract

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all limb bone fractures fail to heal completely due to the extent of the trauma, disease, or age of the patient. Our ability to improve bone regenerative strategies is critically dependent on the ability to mimic serious bone trauma in test animals, but the generation and stabilization of large bone lesions is technically challenging. In most cases, serious long bone trauma is mimicked experimentally by establishing a defect that will not naturally heal. This is achieved by complete removal of a bone segment that is larger than 1.5 times the diameter of the bone cross-section. The bone is then stabilized with a metal implant to maintain proper orientation of the fracture edges and allow for mobility.

Due to their small size and the fragility of their long bones, establishment of such lesions in mice are beyond the capabilities of most research groups. As such, long bone defect models are confined to rats and larger animals. Nevertheless, mice afford significant research advantages in that they can be genetically modified and bred as immune-compromised strains that do not reject human cells and tissue.

Herein, we demonstrate a technique that facilitates the generation of a segmental defect in mouse femora using standard laboratory and veterinary equipment. With practice, fabrication of the fixation device and surgical implantation is feasible for the majority of trained veterinarians and animal research personnel. Using example data, we also provide methodologies for the quantitative analysis of bone healing for the model.

Introduction

On estime que la moitié de la population américaine l'expérience d'une fracture à l'âge de 65 ^1. Pour les patients atteints de fractures traitées chirurgicalement, 500 000 procédures impliquent l'utilisation d'un greffon osseux ² et ce nombre devrait augmenter avec une population vieillissante de plus en plus ³ . Bien que l'os est l'un des rares organes qui a la capacité de guérir complètement sans laisser de cicatrices, il ya des cas où le processus échoue ^3,4. Selon les circonstances et la qualité du traitement, 2-30% des fractures des os longs, provoquant ainsi non syndiqué ^3,5. Bien qu'il reste un débat sur ​​la définition, la pseudarthrose, lésions osseuses critiques taille ou non syndiqués se réfère généralement à une blessure qui ne guérit pas sur la durée de vie naturelle de l'objet ^6. À des fins expérimentales, cette durée est ramenée à la durée moyenne nécessaire pour la guérison complète d'une blessure de taille moyenne os. Lésions osseuses non syndiqués se produisent pour numbreuses raisons, mais les principaux facteurs comprennent traumatismes extrêmes résultant en un écart de taille critique, une infection, une mauvaise angiogenèse, l'usage du tabac, ou la capacité de osteoregenerative inhibée en raison de maladie ou d'âge de ⁷ ans. Même si les non-syndicats sont traités avec succès, il peut coûter plus de $ 60 000 par la procédure, selon le type de blessure et les approches utilisées ^8.

Dans les cas modérés, greffe osseuse autologue est employé. Cette stratégie implique la récupération de l'os à partir d'un site donneur et l'implantation sur le site de la blessure. Bien que cette approche est extrêmement efficace, le volume de l'os disponible des donateurs dérivés est limité et la procédure implique une intervention chirurgicale supplémentaire, qui se traduit par une douleur persistante dans de nombreux patients ^9,10. En outre, l'efficacité de la greffe osseuse autologue dépend de la santé du patient. substituts osseux synthétiques fabriqués à partir de matériaux ou de la moelle cadavérique traitées sont abondamment disponibles ^11-13, mais ils Have des limitations importantes, y compris les pauvres propriétés d'adhérence hôte cellulaire, ostéoconductivité réduite, et le potentiel de rejet immunitaire ^14. Il ya donc un besoin urgent de technologies de régénération osseuse qui sont sûrs, efficaces et largement disponible.

Notre capacité à améliorer les stratégies de régénération osseuse dépend essentiellement de la capacité d'imiter graves traumatismes des os chez les animaux d'essai, mais la génération et la stabilisation de grandes lésions osseuses est techniquement difficile. Dans la plupart des cas, de graves traumatismes des os longs est imité expérimentalement en établissant un défaut qui ne seront pas guérir naturellement. Bien qu'elle puisse varier avec les espèces ^15, ceci est obtenu par l'élimination complète d'un segment d'os qui est supérieure à 1,5 fois le diamètre de l'os en coupe ^16. L'os est ensuite stabilisé avec un implant métallique pour maintenir une orientation correcte des bords de la fracture et permettre la mobilité. En raison de leur petite taille et la fragilité deleurs os longs, l'établissement de telles lésions chez les souris sont au-delà des capacités de la plupart des groupes de recherche. En tant que tel, les modèles de défauts des os longs sont confinés à des rats et des animaux plus gros. Néanmoins, les souris présentent des avantages significatifs de recherche en ce sens qu'ils peuvent être génétiquement modifiés et élevés que les souches immunodéprimés qui ne rejettent cellules et de tissus humains.

Pour les applications à base de cellules humaines, des souris immunodéprimées sont attrayants pour travailler avec, car ils sont physiologiquement bien caractérisés, facile à la maison, rentables, et facilement analysés radiologiquement et histologiquement. Est d'une importance primordiale que les souris immunodéprimées ne rejettent pas les cellules de différentes espèces, dont les humains. Leur petite taille permet également l'essai de très petits nombres de cellules ou des volumes d'échafaudages expérimentaux dans des applications orthopédiques. Plusieurs modèles murins orthopédiques ont été signalé que permettre différents degrés de stabilité osseuse ^17,18. Ceux systems qui aboutissent à des niveaux très élevés de stabilité, tels que des fixateurs externes et plaques de verrouillage guérissent principalement par l'ossification endochondrale intramembranaire bien la guérison a été rapporté ^19. En revanche, celles qui permettent certaines micro et / ou macro-mouvement, tels que ceux employant broches médullaires non fixées ou partiellement fixes, guérir généralement avec une prédominance de l'ossification endochondrale ^20,21. Union retardée ou défauts non syndiqués de os long sont particulièrement difficiles à obtenir chez des souris en raison du niveau supplémentaire de stabilisation requise. Cependant, un certain nombre d'approches ont été signalés, y compris broches médullaires avec des clous de verrouillage, plaques de verrouillage et des fixateurs externes ^22. Ces systèmes fonctionnent généralement bien, mais étant donné leur conception compliquée ils peuvent être techniquement difficile à installer. Par exemple, Garcia et al. ²³ conçu un élégant système d'axe de verrouillage pour une utilisation chez les souris, mais la procédure implique des incisions à deux site distincts et une modification importante du fémur pour recevoir les tiges. Ces procédures ont été effectuées sous un microscope à dissection.

Nous décrivons ici d'une simple broche médullaire fémoral d'une collerette centrale destinée à empêcher la fermeture d'un déficit osseux de 3 mm et également délimiter les bords d'origine du défaut. Bien que la broche n'a pas été fixé à l'os lui-même, le dimensionnement précis du diamètre de la broche et l'alésage du résultat de la cavité médullaire interférence suffisante pour minimiser le mouvement de torsion (figure 1). Avec une sélection rigoureuse de consanguin âge, du sexe et des souris de souche appariés, le résultat est une non-uniondefect hypertrophique hautement reproductible ²² qui peut être facilement évaluée par radiologie. De plus les régions d'intérêt peuvent être définies de manière reproductible après la micro-tomographie (μCT) pour la mesure de la formation de novo de l'os et les paramètres histomorphologiques. Les broches ont été prototypé dans notre laboratoire en utilisant des outils facilement disponibles.

Figure 1: principe expérimental résumé schématique du modèle de défaut segmentaire.. Le segment central 3 mm d'un fémur de souris 9-10 mm est excisé chirurgicalement (à gauche). Un tube en acier chirurgical de calibre 19 3 mm de long est passé sur un 9 mm de long, 22 G tube en acier inoxydable et fixe avec colle exactement au centre (à droite). La tige résultante est ajusté dans les canaux médullaires des parties proximale et distale du fémur restant avec le collier 19 G en remplaçant le segment de 3 mm d'os (ci-dessous, au centre).

Protocol

NOTE: Ce protocole est conçu pour nude (Nu / J) des souris femelles (18-25 g, 6 semaines) acquis auprès de Jackson Laboratories. Depuis souches de souris varient légèrement en termes d'anatomie et de taux de croissance, nous vous conseillons de la fabrication de broches est optimisé pour la souche, le sexe et l'âge des bénéficiaires avant l'implantation dans des sujets vivants. Si les souches sont appariés avec soin, l'ajustement serré entre la broche et la cavité de la moelle osseuse est trè…

Representative Results

Souris récupèrent la conscience et des membres postérieurs mobilité 5-10 minutes après l'arrêt de l'anesthésie. Pendant les 5 premiers jours, il est conseillé de loger souris individuellement et introduire enrichissement de l'environnement pour éviter l'utilisation excessive de la branche. A cet effet, les nids de type igloo réduisent la nécessité de la construction du nid et encouragent repos. Nous avons également observé que la fourniture d'aliments et d'hydrogel sur le plancher d…

Discussion

Nous décrivons ici une méthode simple pour générer un défaut critique taille pin-stabilisé du fémur murin utilisant laboratoire standard et vétérinaire. Tandis que l'ensemble des broches et la procédure chirurgicale elle-même exige de la pratique, ce est bien dans les capacités d'un scientifique de recherche biomédicale bien formé ou un vétérinaire.

La broche est positionnée dans le canal médullaire sans fixation supplémentaire, rendant la procédure plus faisable …

Materials

Name of Equipment/Material*	Company	Catalog or model	Notes
Pin Assembly
Dremel rotary tool	Dremel	8220	or equivalent
Heavy duty cut off wheel	Dremel	420
Surgical tubing 19G	Small Parts (Amazon)	B000FMZ8LY	OD 1.07mm, ID 0.889mm
Surgical tubing 21G	Small Parts (Amazon)	B000FMZ8YQ	OD 0.82mm, ID 0.635mm
Surgical tubing 22G	Small Parts (Amazon)	B000FMYLZS	OD 0.719mm, ID 0.502mm
Surgical tubing 23G	Small Parts (Amazon)	B000FN0SY0	OD 0.643mm, ID 0.444mm
Cyanoacrylate adhesive	Loctite	1365882
Emery disc	Dremel	413
Rubber polishing point	Dremel	462
Felt polishing disc	Dremel	414
Gelatin sponge	Surgifoam/Ethicon	1974
Punch biopsy cutter	Miltex	33-34
Surgery/post-operative
Warm pad and circulator pump	Stryker/Thermocare	TP700, TP700C, TPP722
Coverage quaternary spray	Steris	1429-77
Bead sterilizer	Germinator/CellPoint Scentific	Germinator 500
Anesthesia system	VetEquip Inc	901806 or 901807/901809
Isofluorane anesthetic	VETone/MWI	501017, 502017
Surgical disinfectant	Chloraprep/CareFusion	260449
Surgical tools	Fine Science Tools	various	recommend German made
Face protection	Splash Shield	4505
Rechargable high speed drill	Fine Science Tools	18000-17
Diamond cutting wheel	Strauss Diaiond	361.514.080HP
Absorbable sutures	Covidien	UM-213
Outer sutures	Ethicon	668G	or equivalent
Vetbond	3M	1469SB	or equivalent
Hydration gel	Clear H2O	70-01-1082
Diet gel	Clear H2O	72-01-1062
Buprenorphine	Reckitt and Benckser	12496-0757-01	controlled substance
Mouse igloos	Bio Serv	K3328, 3570,3327
Euthanasia cocktail	Euthasol/Virbac	710101	controlled substance
Analysis
Live animal imager	Orthoscan	FD Pulse	or equivalent
Micro-CT unit and software	Bruker	Skyscan1174	or equivalent
Sealing film/Parafilm M	VWR or Fisher	100501-338, S37441
*Generic sources are suitable for all other items such as gause, drapes, protective clothing, animal care equipment.