En simpel kritisk størrelse Femoral Defekt Model i mus

Summary

Animal models are frequently employed to mimic serious bone injury in biomedical research. Due to their small size, establishment of stabilized bone lesions in mice are beyond the capabilities of most research groups. Herein, we describe a simple method for establishing and analyzing experimental femoral defects in mice.

Abstract

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all limb bone fractures fail to heal completely due to the extent of the trauma, disease, or age of the patient. Our ability to improve bone regenerative strategies is critically dependent on the ability to mimic serious bone trauma in test animals, but the generation and stabilization of large bone lesions is technically challenging. In most cases, serious long bone trauma is mimicked experimentally by establishing a defect that will not naturally heal. This is achieved by complete removal of a bone segment that is larger than 1.5 times the diameter of the bone cross-section. The bone is then stabilized with a metal implant to maintain proper orientation of the fracture edges and allow for mobility.

Due to their small size and the fragility of their long bones, establishment of such lesions in mice are beyond the capabilities of most research groups. As such, long bone defect models are confined to rats and larger animals. Nevertheless, mice afford significant research advantages in that they can be genetically modified and bred as immune-compromised strains that do not reject human cells and tissue.

Herein, we demonstrate a technique that facilitates the generation of a segmental defect in mouse femora using standard laboratory and veterinary equipment. With practice, fabrication of the fixation device and surgical implantation is feasible for the majority of trained veterinarians and animal research personnel. Using example data, we also provide methodologies for the quantitative analysis of bone healing for the model.

Introduction

Det anslås, at halvdelen af den amerikanske befolkning oplever en fraktur i en alder af 65 ^1. For de patienter med frakturer behandles kirurgisk, 500.000 procedurer indebærer brug af en knogletransplantation ² og dette tal forventes at stige med en stadig aldrende befolkning ³ . Selv om knoglen er en af de få organer, der har kapacitet til helt heler uden ardannelse, er der tilfælde, hvor processen ikke ^3,4. Afhængig af omstændighederne og kvalitet i behandlingen, 2-30% af lange knoglebrud mislykkes, hvilket resulterer i ikke-union ^3,5. Mens der stadig er en vis debat om definition, pseudoarthrose, kritiske størrelse eller ikke-union knogleskader generelt refererer til en skade, der ikke heler i løbet af naturlige levetid emne ^6. Til forsøgsformål, er denne varighed afkortes til den gennemsnitlige tid, der kræves til fuldstændig helbredelse af en gennemsnitlig størrelse knogle skade. Ikke-union knoglelæsioner forekomme numerous grunde, men vigtige faktorer omfatter ekstrem traume resulterer i en kritisk størrelse hul, infektion, dårlig angiogenese, tobaksrygning eller hæmmet osteoregenerative kapacitet på grund af sygdom eller alder ^7. Selv om ikke-fagforeninger med held behandles, kan det koste over $ 60,000 per procedure, afhængigt af typen af skade og de ​​metoder, der anvendes ^8.

I moderate tilfælde er autolog knogletransplantation ansat. Denne strategi indebærer genopretning af knogle fra en donor websted og implantation på skadestedet. Selv om denne fremgangsmåde er ekstremt effektiv, mængden af tilgængelige donor-afledte knogle er begrænset, og procedure indebærer en yderligere operation, hvilket resulterer i vedvarende smerter i mange patienter ^9,10. Desuden effektiviteten af ​​autolog knogletransplantation er afhængig af patientens helbred. Bone erstatninger fremstillet af syntetiske materialer eller forarbejdet afdød knogle er rigeligt til rådighed ^11-13, men de have væsentlige begrænsninger, herunder dårlige host-celle adhæsionsegenskaber, reduceret osteokonduktivitet, og mulighederne for immunafstødning ^14. Der er derfor et presserende behov for knogleregenerering teknologier, som er sikker, effektiv og bredt tilgængelige.

Vores evne til at forbedre knogle regenerative strategier er kritisk afhængig af evnen til at efterligne alvorlig knogle traumer i forsøgsdyr, men genereringen og stabilisering af store knoglelæsioner er teknisk udfordrende. I de fleste tilfælde er alvorlig lang knogle traumer efterlignes eksperimentelt ved at etablere en defekt, som ikke naturligt helbrede. Selvom det kan variere med arter ^15, opnås dette ved fuldstændig fjernelse af en knogle segment, der er større end 1,5 gange diameteren af knoglen tværsnit ^16. Knoglen derefter stabiliseret med et metalimplantat til at opretholde korrekt orientering af bruddet kanter og give mulighed for mobilitet. På grund af deres lille størrelse og skrøbelighedderes lange ben, etablering af sådanne læsioner i mus er ud over mulighederne i de fleste forskningsgrupper. Som sådan er lang knogledefekt modeller begrænset til rotter og større dyr. Alligevel mus gav en betydelig forskningsindsats fordele, at de kan være genetisk modificerede og opdrættet som immunsvækkede stammer, som afviser ikke humane celler og væv.

For humane celle-baserede applikationer, immunsvækkede mus er attraktive at arbejde med, fordi de er fysiologisk velkarakteriseret, let at hus, omkostningseffektiv og let analyserede radiologisk og histologisk. Af afgørende betydning er, at immunsvækkede mus ikke afviser celler fra forskellige arter, herunder mennesker. Deres lille størrelse tillader også afprøvning af et meget lille antal celler eller mængder af eksperimentelle stilladser i ortopædiske applikationer. Flere murine ortopædiske modeller er blevet rapporteret, at tillade forskellige grader af knogle stabilitet ^17,18. De, systems, der resulterer i meget høje niveauer af stabilitet, såsom eksterne fikseringsindretninger og låseplader overvejende helbrede ved intramembranous ossifikation selvom endochondral heling er rapporteret ^19. I modsætning hertil dem, der tillader nogle mikro- og / eller makro-bevægelse, som dem, der anvender ikke-fikserede eller delvist faste medullære pins, generelt helbrede med en overvægt af endochondral ossifikation ^20,21. Forsinket union eller non-union-defekter af lange knogler er særligt vanskeligt at opnå i mus på grund af den ekstra niveau af stabilisering nødvendig. Imidlertid er der rapporteret en række metoder, herunder medullære pins med sikringsanlæg søm, låseplader og eksterne fikseringsindretninger ^22. Disse systemer fungerer generelt godt, men i betragtning af deres komplicerede design, de kan være teknisk udfordrende at installere. For eksempel Garcia et al. ²³ udtænkt en elegant sikringsanlæg pin til anvendelse i mus, men proceduren indebærer indsnit på to separate websteds og omfattende ændring af lårbenet til at rumme benene. Disse procedurer blev udført under et dissektionsmikroskop.

Heri beskriver vi en simpel femoral medullær pin med en central krave designet til at forhindre lukning af en 3 mm knogle underskud og også afgrænse de oprindelige kanter defekten. Mens pin ikke var fastgjort til selve knoglen, til præcis dimensionering af stiften diameter og rivning af marvhulen resulterer i tilstrækkelig interferens minimere torsionsstivhed bevægelse (figur 1). Med omhyggelig udvælgelse af indavlede alder, køn og stamme-matchede mus, er resultatet en meget reproducerbar hypertrofisk ikke-uniondefect ^22, som let kan evalueres radiologisk. Desuden områder af interesse kan reproducerbart defineres efter mikro-computertomografi (μCT) til måling af de novo knogledannelse og histomorfologisk parametre. Stifterne blev prototype i vores laboratorium ved hjælp af let tilgængelige værktøjer.

Figur 1: Eksperimentel princip Skematisk oversigt over den segmentdefekt model.. Den centrale 3 mm segment af en 9-10 mm murine lårben udskæres kirurgisk (venstre). En 3 mm lang, 19 gauge kirurgisk stål rør er ført over en 9 mm lange, 22 g rustfrit stålrør og fastgjort med klæbestof på det nøjagtige centrum (højre). Den resulterende stift monteret i medullære kanaler af de øvrige proximale og distale dele af femur med 19 g krave erstatte 3 mm segment af knogle (nedenfor i midten).

Protocol

BEMÆRK: Denne protokol er beregnet til kvindelige nøgen (nu / J) mus (18-25 g, 6 uger) erhvervet fra Jackson Laboratories. Da stammer af mus variere en smule i forhold til anatomi og vækst, anbefaler vi, at fremstillingen af ​​stifter er optimeret til stammen, køn og alder af modtagerne inden implantation i levende fag. Hvis stammerne omhyggeligt matches, prespasningen mellem tappen og marvkavitetsareal er meget reproducerbar. Procedurer for boliger, kost og generel dyrehold er uden for rammerne af denne protoko…

Representative Results

Mus typisk genvinde bevidstheden og Hind-lemmer mobilitet 5-10 minutter efter tilbagetrækning af anæstesi. I løbet af de første 5 dage, er det tilrådeligt at huse mus individuelt og indføre miljøberigelse at forhindre overdreven brug af lemmet. Til dette formål iglo-type reder reducere behovet for redebygning og tilskynde hvile. Vi har også observeret, at levering af mad og hydrogel på gulvet i buret reducerer sandsynligheden for pin forskydning. I perioden 5 dage, bør analgesi administreres efter behov i ove…

Discussion

Heri beskriver vi en simpel metode til at generere en kritisk størrelse pin-stabiliserede defekt af den murine femur ved anvendelse af standard laboratorieudstyr og veterinære udstyr. Mens samlingen af ​​benene og kirurgiske procedure selv kræver praksis, er det godt inden mulighederne i en veluddannet biomedicinsk forsker eller dyrlæge.

Stiften er placeret i marvkanalen uden yderligere fiksering, hvilket gør proceduren teknisk mere gennemførlige end mere komplicerede metoder, der …

Materials

Name of Equipment/Material*	Company	Catalog or model	Notes
Pin Assembly
Dremel rotary tool	Dremel	8220	or equivalent
Heavy duty cut off wheel	Dremel	420
Surgical tubing 19G	Small Parts (Amazon)	B000FMZ8LY	OD 1.07mm, ID 0.889mm
Surgical tubing 21G	Small Parts (Amazon)	B000FMZ8YQ	OD 0.82mm, ID 0.635mm
Surgical tubing 22G	Small Parts (Amazon)	B000FMYLZS	OD 0.719mm, ID 0.502mm
Surgical tubing 23G	Small Parts (Amazon)	B000FN0SY0	OD 0.643mm, ID 0.444mm
Cyanoacrylate adhesive	Loctite	1365882
Emery disc	Dremel	413
Rubber polishing point	Dremel	462
Felt polishing disc	Dremel	414
Gelatin sponge	Surgifoam/Ethicon	1974
Punch biopsy cutter	Miltex	33-34
Surgery/post-operative
Warm pad and circulator pump	Stryker/Thermocare	TP700, TP700C, TPP722
Coverage quaternary spray	Steris	1429-77
Bead sterilizer	Germinator/CellPoint Scentific	Germinator 500
Anesthesia system	VetEquip Inc	901806 or 901807/901809
Isofluorane anesthetic	VETone/MWI	501017, 502017
Surgical disinfectant	Chloraprep/CareFusion	260449
Surgical tools	Fine Science Tools	various	recommend German made
Face protection	Splash Shield	4505
Rechargable high speed drill	Fine Science Tools	18000-17
Diamond cutting wheel	Strauss Diaiond	361.514.080HP
Absorbable sutures	Covidien	UM-213
Outer sutures	Ethicon	668G	or equivalent
Vetbond	3M	1469SB	or equivalent
Hydration gel	Clear H2O	70-01-1082
Diet gel	Clear H2O	72-01-1062
Buprenorphine	Reckitt and Benckser	12496-0757-01	controlled substance
Mouse igloos	Bio Serv	K3328, 3570,3327
Euthanasia cocktail	Euthasol/Virbac	710101	controlled substance
Analysis
Live animal imager	Orthoscan	FD Pulse	or equivalent
Micro-CT unit and software	Bruker	Skyscan1174	or equivalent
Sealing film/Parafilm M	VWR or Fisher	100501-338, S37441
*Generic sources are suitable for all other items such as gause, drapes, protective clothing, animal care equipment.