En enkel Kritisk store Femoral Defect Model i Mus

Summary

Animal models are frequently employed to mimic serious bone injury in biomedical research. Due to their small size, establishment of stabilized bone lesions in mice are beyond the capabilities of most research groups. Herein, we describe a simple method for establishing and analyzing experimental femoral defects in mice.

Abstract

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all limb bone fractures fail to heal completely due to the extent of the trauma, disease, or age of the patient. Our ability to improve bone regenerative strategies is critically dependent on the ability to mimic serious bone trauma in test animals, but the generation and stabilization of large bone lesions is technically challenging. In most cases, serious long bone trauma is mimicked experimentally by establishing a defect that will not naturally heal. This is achieved by complete removal of a bone segment that is larger than 1.5 times the diameter of the bone cross-section. The bone is then stabilized with a metal implant to maintain proper orientation of the fracture edges and allow for mobility.

Due to their small size and the fragility of their long bones, establishment of such lesions in mice are beyond the capabilities of most research groups. As such, long bone defect models are confined to rats and larger animals. Nevertheless, mice afford significant research advantages in that they can be genetically modified and bred as immune-compromised strains that do not reject human cells and tissue.

Herein, we demonstrate a technique that facilitates the generation of a segmental defect in mouse femora using standard laboratory and veterinary equipment. With practice, fabrication of the fixation device and surgical implantation is feasible for the majority of trained veterinarians and animal research personnel. Using example data, we also provide methodologies for the quantitative analysis of bone healing for the model.

Introduction

Det er anslått at halvparten av den amerikanske befolkningen opplever et brudd i en alder av 65 ^1. For pasienter med frakturer behandles kirurgisk, 500.000 prosedyrer innebære bruk av et bein pode ² og dette tallet forventes å stige med en stadig aldrende befolkning ³ . Selv om benet er en av de få organer som har kapasitet til å helbrede fullstendig uten arrdannelse, er det tilfeller hvor prosessen mislykkes ^3,4. Avhengig av omstendighetene og kvaliteten av behandlingen, 2-30% av lange benbrudd svikte, noe som resulterer i ikke-forening ^3,5. Mens det gjenstår en del debatt om definisjonen, pseudoarthrosis, kritiske størrelse eller uorganiserte skader bein generelt refererer til en skade som ikke gror over naturlige levetid av faget ^6. For eksperimentelle formål, er dette varighet forkortet til den gjennomsnittlige tiden som kreves for fullstendig helbredelse av en gjennomsnittlig størrelse bein skade. Uorganiserte benlesjoner oppstå for numerous grunner, men viktige faktorer inkluderer ekstreme traumer som resulterer i en kritisk størrelse gap, infeksjon, dårlig angiogenese, bruk av tobakk, eller hemmet osteoregenerative kapasitet på grunn av sykdom eller alder ^7. Selv om ikke-fagforeninger er vellykket behandlet, kan det koste i overkant av $ 60 000 per prosedyre, avhengig av type skade og tilnærminger ansatt ^åtte.

I moderate tilfeller er autolog bein pode ansatt. Denne strategien innebærer utvinning av bein fra en donor området og implantering på stedet av skader. Selv om denne fremgangsmåte er meget effektiv, er volumet av tilgjengelig donor-avledede ben begrenset, og fremgangsmåten innebærer en ekstra operasjon, noe som resulterer i vedvarende smerte hos mange pasienter ^9,10. I tillegg er effekten av det autologe benimplantat avhengig av tilstanden til pasienten. Bensubstitutter laget av syntetiske materialer eller behandlet avdød bein er rikelig tilgjengelig ^11-13, men de Håve betydelige begrensninger, inkludert fattige host-celle adhesjon egenskaper, redusert osteoconductivity, og potensialet for immun avvisning ^14. Det er derfor et stort behov for bein regenerering teknologier som er trygg, effektiv og allment tilgjengelig.

Evnen til å forbedre ben regenerative strategier er kritisk avhengig av evnen til å etterligne ben alvorlig traume i forsøksdyr, men genereringen og stabiliseringen av store benlesjoner er teknisk utfordrende. I de fleste tilfeller er alvorlig lange ben traumer lignet eksperimentelt ved å etablere en defekt som ikke vil naturligvis gro. Selv om det kan variere med arten ^15, er dette oppnådd ved fullstendig fjerning av et bein segment som er større enn 1,5 ganger diameteren av benet tverrsnitt ^16. Benet blir så stabilisert med et metallimplantat for å opprettholde korrekt orientering av bruddkantene og gir mulighet for mobilitet. På grunn av sin lille størrelse og skjørhetensine lange bein, etablering av slike lesjoner hos mus er utover egenskapene til de fleste forskningsmiljøer. Som sådan, er lang bendefekten modeller begrenset til rotter og større dyr. Likevel mus ga betydelige forsknings fordeler ved at de kan bli genetisk modifisert, og oppdrettet som svekket immunforsvar stammer som ikke avviser humane celler og vev.

For humane celle-baserte applikasjoner, svekket immunforsvar mus er attraktivt å jobbe med fordi de er fysiologisk godt karakterisert, lett å huset, kostnadseffektivt, og enkelt analysert radiologisk og histologisk. Av avgjørende betydning er at svekket immunforsvar mus ikke avvise celler fra forskjellige arter, inkludert mennesker. Den hendige størrelsen gjør det også testing av meget lite antall celler eller volumer av eksperimentelle stillas i ortopediske applikasjoner. Flere murine ortopediske modeller har blitt rapportert at råd til ulike grader av bein stabilitet ^17,18. De systems som resulterer i svært høye nivåer av stabilitet, for eksempel eksterne fixators og låseplater overveiende helbrede ved intramembranøse forbening selv endochondral helbredelse har blitt rapportert ^19. I kontrast til de som tillater en viss mikro- og / eller makro bevegelse, slik som de som anvender ufikserte eller delvis faste medullære pinner, vanligvis helbrede med en overvekt av endochondral ossifikasjon ^20,21. Forsinket union eller uorganiserte defekter av lange ben er spesielt vanskelig å oppnå i mus på grunn av den ekstra stabiliseringsnivå som kreves. Imidlertid er det rapportert en rekke tilnærminger, inkludert medullære pins med sikringsanlegg negler, låseplater og eksterne fixators ^22. Disse systemene generelt fungerer godt, men gitt sin komplisert design de kan være teknisk utfordrende å installere. For eksempel Garcia et al., ²³ utformet en elegant sammenlåsende stiften system for bruk i mus, men fremgangsmåten innebærer innsnitt på to separate reisers og omfattende modifikasjon av femur for å få plass til pinnene. Disse prosedyrer ble utført under et disseksjonsmikroskop.

Heri beskrives en enkel femoral margstiften med en sentral krave utformet for å hindre lukking av en 3 mm ben underskudd og også avgrense de opprinnelige kantene av defekten. Mens pinnen ikke ble festet til benet i seg selv, for å nøyaktig dimensjonering av diameteren stiften og opprømming av marghulen resulterer i tilstrekkelig interferens minimal torsjonsbevegelse (figur 1). Med nøye utvelgelse av innavlet alder, kjønn og stamme matchet mus, er resultatet en svært reproduserbare hypertrofisk ikke-uniondefect ²² som lett kan evalueres radiologisk. Videre regioner av interesse kan reproduserbart definert etter mikro-computertomografi (μCT) for måling av de novo bendannelse og histomorphological parametere. Pinnene ble prototyper i vårt laboratorium ved hjelp av lett tilgjengelige verktøy.

Figur 1: Eksperimentell prinsipp diagrammatisk oppsummering av segmental defekt modell.. Den sentrale 3 mm segment av en 9-10 mm murine femur blir skåret kirurgisk (til venstre). En 3 mm lang, 19 måler kirurgisk stålrøret er ført over en 9 mm lang, 22 G rustfritt stålrør og festes med klebemiddel på den nøyaktige senter (høyre). Den resulterende stiften er montert inn i marg kanalene i de resterende proksimale og distale partier av lårbenet med 19 g kragen å erstatte 3 mm segment av ben (nedenfor midten).

Protocol

MERK: Denne protokollen er laget for kvinnelig naken (Nu / J) mus (18-25 g, 6 uker) kjøpt fra Jackson Laboratories. Siden stammer av mus variere litt i form av anatomi og vekst, anbefaler vi at fabrikasjon av pinnene er optimalisert til belastningen, kjønn og alder av mottakerne før implantering i levende fag. Dersom stammene er nøye avstemt, er presspasning mellom tappen og marghulen meget reproduserbar. Prosedyrer for bolig, kosthold og generell husdyrhold er utenfor rammen av denne protokollen, men alle mus ble p…

Representative Results

Mus vanligvis gjenopprette bevissthet og hind-lem mobilitet 5-10 minutter etter tilbaketrekking av anestesi. I løpet av de første fem dagene, er det tilrådelig å huse mus individuelt og innføre miljøberikelse for å hindre overdreven bruk av lem. For dette formålet, igloo-type reir redusere behovet for reir bygg og oppmuntre hvile. Vi har også observert at bestemmelsen av mat og hydrogel på gulvet i buret reduserer sannsynligheten for at pinnen forskyvning. I løpet av fem-dagers periode, bør analgesi administ…

Discussion

Heri, beskriver vi en enkel metode for å generere en kritisk størrelse pin-stabilisert defekt i murine lårbenet ved anvendelse av standard laboratorieutstyr og veterinær. Mens forsamlingen av pinnene og den kirurgiske prosedyren i seg selv krever øvelse, er det godt innenfor mulighetene til en velt biomedisinsk forsker eller veterinær.

Pinnen er plassert i margkanalen uten ytterligere fiksering, noe som gjør fremgangsmåten mer teknisk gjennomførbar enn de mer kompliserte fremgangsm?…

Materials

Name of Equipment/Material*	Company	Catalog or model	Notes
Pin Assembly
Dremel rotary tool	Dremel	8220	or equivalent
Heavy duty cut off wheel	Dremel	420
Surgical tubing 19G	Small Parts (Amazon)	B000FMZ8LY	OD 1.07mm, ID 0.889mm
Surgical tubing 21G	Small Parts (Amazon)	B000FMZ8YQ	OD 0.82mm, ID 0.635mm
Surgical tubing 22G	Small Parts (Amazon)	B000FMYLZS	OD 0.719mm, ID 0.502mm
Surgical tubing 23G	Small Parts (Amazon)	B000FN0SY0	OD 0.643mm, ID 0.444mm
Cyanoacrylate adhesive	Loctite	1365882
Emery disc	Dremel	413
Rubber polishing point	Dremel	462
Felt polishing disc	Dremel	414
Gelatin sponge	Surgifoam/Ethicon	1974
Punch biopsy cutter	Miltex	33-34
Surgery/post-operative
Warm pad and circulator pump	Stryker/Thermocare	TP700, TP700C, TPP722
Coverage quaternary spray	Steris	1429-77
Bead sterilizer	Germinator/CellPoint Scentific	Germinator 500
Anesthesia system	VetEquip Inc	901806 or 901807/901809
Isofluorane anesthetic	VETone/MWI	501017, 502017
Surgical disinfectant	Chloraprep/CareFusion	260449
Surgical tools	Fine Science Tools	various	recommend German made
Face protection	Splash Shield	4505
Rechargable high speed drill	Fine Science Tools	18000-17
Diamond cutting wheel	Strauss Diaiond	361.514.080HP
Absorbable sutures	Covidien	UM-213
Outer sutures	Ethicon	668G	or equivalent
Vetbond	3M	1469SB	or equivalent
Hydration gel	Clear H2O	70-01-1082
Diet gel	Clear H2O	72-01-1062
Buprenorphine	Reckitt and Benckser	12496-0757-01	controlled substance
Mouse igloos	Bio Serv	K3328, 3570,3327
Euthanasia cocktail	Euthasol/Virbac	710101	controlled substance
Analysis
Live animal imager	Orthoscan	FD Pulse	or equivalent
Micro-CT unit and software	Bruker	Skyscan1174	or equivalent
Sealing film/Parafilm M	VWR or Fisher	100501-338, S37441
*Generic sources are suitable for all other items such as gause, drapes, protective clothing, animal care equipment.