Простой Critical размера бедренной кости Дефект Модель на мышах

Summary

Animal models are frequently employed to mimic serious bone injury in biomedical research. Due to their small size, establishment of stabilized bone lesions in mice are beyond the capabilities of most research groups. Herein, we describe a simple method for establishing and analyzing experimental femoral defects in mice.

Abstract

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all limb bone fractures fail to heal completely due to the extent of the trauma, disease, or age of the patient. Our ability to improve bone regenerative strategies is critically dependent on the ability to mimic serious bone trauma in test animals, but the generation and stabilization of large bone lesions is technically challenging. In most cases, serious long bone trauma is mimicked experimentally by establishing a defect that will not naturally heal. This is achieved by complete removal of a bone segment that is larger than 1.5 times the diameter of the bone cross-section. The bone is then stabilized with a metal implant to maintain proper orientation of the fracture edges and allow for mobility.

Due to their small size and the fragility of their long bones, establishment of such lesions in mice are beyond the capabilities of most research groups. As such, long bone defect models are confined to rats and larger animals. Nevertheless, mice afford significant research advantages in that they can be genetically modified and bred as immune-compromised strains that do not reject human cells and tissue.

Herein, we demonstrate a technique that facilitates the generation of a segmental defect in mouse femora using standard laboratory and veterinary equipment. With practice, fabrication of the fixation device and surgical implantation is feasible for the majority of trained veterinarians and animal research personnel. Using example data, we also provide methodologies for the quantitative analysis of bone healing for the model.

Introduction

Считается, что половина населения США испытывают на разрыв в возрасте 65 ^1. Для тех пациентов с переломами хирургическое лечение, 500000 процедуры предусматривают использование костного трансплантата ^2, и это число будет расти с более стареющего населения ³ , Хотя кости является одним из немногих органов, который имеет потенциал, чтобы полностью исцелить без рубцов, бывают случаи, когда процесс не ^3,4. В зависимости от обстоятельств и качество лечения, 2-30% от переломов длинных костей неудачу, в результате чего не состоящих в профсоюзе ^3,5. Хотя остаются некоторые дебаты по определению, ложных, критических размеров или не состоящих в профсоюзе повреждений костей, как правило, относится к травме, которая не заживает в течение естественного жизни субъекта ^6. Для экспериментальных целей, эта продолжительность сокращается в среднем время, необходимое для полного заживления среднего размера травмы костей. Номера для профсоюзов повреждения кости происходят на питгими причинами, но основные факторы включают в себя тяжелейшие психологические травмы в результате критически размера зазора, инфекции, плохое ангиогенеза, употребление табака, или заторможенной мощностью osteoregenerative из-за болезни или возраста ^7. Даже если она не профсоюзы успешно лечить, она может стоить более $ 60000 в порядке, в зависимости от типа травмы и подходов, используемых ^8.

В умеренных случаях используется аутологичных костная пластика. Эта стратегия включает в себя восстановление кости с сайта донора и имплантации на месте травмы. Хотя такой подход является весьма эффективным, объем доступной доноров, полученных кости ограничен, и процедура включает в себя дополнительную операцию, что приводит к постоянной боли у многих пациентов ^9,10. Кроме того, эффективность в аутологичного костного трансплантата зависит от состояния здоровья пациента. Костные заменители, изготовленные из синтетических материалов или обработанные трупной кости в изобилии доступны ^11-13, но они гаве существенные ограничения, в том числе бедных адгезионных свойств клетки-хозяина, снижение Остеокондуктивность и потенциал для иммунного отторжения ^14. Существует поэтому острая необходимость в регенерации кости технологий, которые являются безопасными, эффективными и широко доступны.

Наша способность улучшить регенеративные стратегии кости в значительной степени зависит от способности имитировать серьезную кости травмы в подопытных животных, но поколение и стабилизация больших костных поражений технически сложной задачей. В большинстве случаев, серьезные травмы длинную кость имитируется экспериментально путем создания дефект, который не будет, естественно, лечить. Хотя это может изменяться в зависимости от вида ^15, это достигается за счет полного удаления сегмента кости, который больше, чем в 1,5 раза диаметр кости поперечным сечением ^16. Затем кости, стабилизированного металлического имплантата, чтобы сохранить правильную ориентацию краев трещин и позволяют мобильности. Из-за их небольшого размера и хрупкостиих длинные кости, создание таких поражений у мышей находятся за пределами возможностей большинства научно-исследовательских групп. Таким образом, модели длинную кость дефект ограничены крыс и более крупных животных. Тем не менее, у мышей себе значительные исследовательские преимущества в том, что они могут быть генетически модифицированные и разводили в ослабленным иммунитетом штаммов, которые не отвергают человека клетки и ткани.

Для приложений, основанных на человеческих клетках мышей иммунитетом являются привлекательными для работы, потому что они являются физиологически хорошо характеризуется, легко дома, экономически эффективным и легко проанализировать рентгенологически и гистологически. Первостепенное значение в том, что у мышей иммунитетом не отвергают клетки от различных видов, включая человека. Их небольшой размер позволяет также тестировать очень небольшого числа клеток или объемов экспериментальных лесов в ортопедической практике. Несколько мышиных ортопедические модели сообщалось, что позволить себе различные степени стабильности костной ^17,18. Те, страховочныеMS, которые приводят к очень высоким уровнем устойчивости, таких как внешние фиксаторы и стопорных пластин преимущественно лечить путем Intramembranous оссификации хотя эндохондральной заживления сообщалось ^19. В отличие от этого, те, которые допускают определенную микро- и / или макро-движение, например те, которые используют нефиксированных или частично фиксированной мозговидной контактов, как правило, заживают с преобладанием эндохондральной окостенения ^20,21. Задержка союз или не союз дефектов длинных костей, особенно трудно достичь в мышах в связи с повышенным уровнем стабилизации требуется. Тем не менее, были зарегистрированы несколько подходов, в том числе мозгового штифтов с блокировкой ногтей, фиксирующих пластин и внешних фиксаторов ^22. Эти системы обычно работают хорошо, но, учитывая их сложную конструкцию, они могут быть технически сложными в установке. Например, Гарсиа и др. ²³ разработали элегантную блокировки системы контактный для использования в мышах, но процедура включает разрезы на двух отдельном местес и обширной модификацией бедренной кости, чтобы приспособить штифты. Эти процедуры были выполнены при вскрытии микроскопом.

Здесь мы опишем простой бедренной мозгового штифт с центральной воротником, предназначенную для предотвращения закрытия 3 мм дефицита костной, а также очертить оригинальные края дефекта. В то время как вывод не был установлен на самой кости, точное определение размеров диаметра шпильки и развёртывания медуллярного результатов полость, в достаточной вмешательства к минимуму торсионного движения (рисунок 1). При тщательном выборе инбредной возраста, пола и деформации соответствием мышей, результат хорошо воспроизводим гипертрофическая без uniondefect ^22, которые могут быть легко оценены рентгенологически. Кроме того регионах, представляющих интерес может быть воспроизводимо определяется после микро-компьютерной томографии (μCT) для измерения De Novo формирования костной ткани и Гистоморфологические параметров. Выводы были прототипы в нашей лаборатории с помощью легко доступных инструментов.

Рисунок 1: Экспериментальная принцип Схематическое резюме сегментной модели дефекта.. Центральный сегмент 3 мм из 9-10 мм мышиного бедра вырезали хирургическим (слева). Длиной 3 мм, 19 калибра хирургической стали трубки пропускают через 9 мм длиной, 22 г трубку из нержавеющей стали и фиксируется с помощью клея точно в центре (справа). Полученный штифт вставлен в мозговых каналов остальных проксимальных и дистальных отделов бедренной кости с 19 г воротник с заменой 3 мм сегмент кости (ниже, в центре).

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол предназначен для женской обнаженной (Nu / J) мышей (18-25 г, 6 недель), полученной из Jackson Laboratories. Так штаммы мышей незначительно отличаться с точки зрения анатомии и темпы роста, мы советуем изготовление булавок оптимизирован для штамма, пола и возраста получателей п…

Representative Results

Мыши обычно выздоравливают сознание и задних конечностей мобильности 5-10 минут после прекращения анестезии. В течение первых 5 дней, желательно, чтобы домовых мышей индивидуально и ввести экологические обогащения для предотвращения избыточного использования конечности. Для этого, гн?…

Discussion

Здесь мы опишем простой метод для создания критической величины контактный стабилизированный дефект мышиного бедра с использованием стандартных лабораторных и ветеринарное оборудование. В то время как сборка выводов и самого хирургического вмешательства требует практики, это хоро?…

Materials

Name of Equipment/Material*	Company	Catalog or model	Notes
Pin Assembly
Dremel rotary tool	Dremel	8220	or equivalent
Heavy duty cut off wheel	Dremel	420
Surgical tubing 19G	Small Parts (Amazon)	B000FMZ8LY	OD 1.07mm, ID 0.889mm
Surgical tubing 21G	Small Parts (Amazon)	B000FMZ8YQ	OD 0.82mm, ID 0.635mm
Surgical tubing 22G	Small Parts (Amazon)	B000FMYLZS	OD 0.719mm, ID 0.502mm
Surgical tubing 23G	Small Parts (Amazon)	B000FN0SY0	OD 0.643mm, ID 0.444mm
Cyanoacrylate adhesive	Loctite	1365882
Emery disc	Dremel	413
Rubber polishing point	Dremel	462
Felt polishing disc	Dremel	414
Gelatin sponge	Surgifoam/Ethicon	1974
Punch biopsy cutter	Miltex	33-34
Surgery/post-operative
Warm pad and circulator pump	Stryker/Thermocare	TP700, TP700C, TPP722
Coverage quaternary spray	Steris	1429-77
Bead sterilizer	Germinator/CellPoint Scentific	Germinator 500
Anesthesia system	VetEquip Inc	901806 or 901807/901809
Isofluorane anesthetic	VETone/MWI	501017, 502017
Surgical disinfectant	Chloraprep/CareFusion	260449
Surgical tools	Fine Science Tools	various	recommend German made
Face protection	Splash Shield	4505
Rechargable high speed drill	Fine Science Tools	18000-17
Diamond cutting wheel	Strauss Diaiond	361.514.080HP
Absorbable sutures	Covidien	UM-213
Outer sutures	Ethicon	668G	or equivalent
Vetbond	3M	1469SB	or equivalent
Hydration gel	Clear H2O	70-01-1082
Diet gel	Clear H2O	72-01-1062
Buprenorphine	Reckitt and Benckser	12496-0757-01	controlled substance
Mouse igloos	Bio Serv	K3328, 3570,3327
Euthanasia cocktail	Euthasol/Virbac	710101	controlled substance
Analysis
Live animal imager	Orthoscan	FD Pulse	or equivalent
Micro-CT unit and software	Bruker	Skyscan1174	or equivalent
Sealing film/Parafilm M	VWR or Fisher	100501-338, S37441
*Generic sources are suitable for all other items such as gause, drapes, protective clothing, animal care equipment.