Introduction
Mesenkymale stamceller (MSC'er) spiller en vigtig rolle i regenerativ medicin og vævsmanipulering. De kan migrere, differentiere i forskellige celletyper 1 og indpode, hvilket gør dem ideelle kandidater til autologe behandlinger 2,3. Sidst, kliniske undersøgelser med MSC'er for knogle og brusk reparation, graft versus host-sygdom eller hjertesygdom blev iværksat 4. Disse MSC'erne kan høstes fra navlestrengen eller fedtvæv, men mest lovende resultater blev opnået fra knoglemarv stamceller 5.
Hoftebenskammen gør det muligt at indsamle en betydelig mængde knoglemarv og tjener derfor som vigtigste sted for aspiration 6. Men kvaliteten af aspirat falder med stigende mængde knoglemarv trukket tilbage. Mens de første 5 ml knoglemarvsaspirat indeholder MSC'er af høj kvalitet, tilbagetrækning af større mængder fører til fortynding af aspirat med perifert blod from den meget vaskulariserede knogle 7. På grund af de nuværende megakaryocytter og blodplader, knoglemarvsaspirater er tilbøjelige til at størkne, medmindre der anvendes antikoagulanter. Men selv med antikoagulantia, kan der forekomme blodpropper.
I knoglemarven, udgør MSC'er kun en lille del af den samlede celle pool 8 og skal udvides i kultur i de fleste væv ingeniør eller terapeutiske anvendelser 4. Kvaliteten af en sådan kultur i høj grad afhænger af den oprindelige celle pool, dvs.., Mangfoldighed og et højt udgangspunkt nummer 9. Lavt antal af MSC'er fra tilbagekøb kan delvis forklares med donor variabilitet. På den anden side, MSC'er fra prøver lav kvalitet kræve længere tid i kultur og udvidet passage for at nå det ønskede antal celler. I begge tilfælde udvides passage er en kilde til celleældning og kan føre til tab af differentiering potentiale 10. Derfor optimerede protokoller, som kan maksimere celle yield og forhindre skadelige virkninger skal udvikles 11,12.
Da vi begyndte at arbejde med hunde MSC, vi var overrasket over at se, at omkring tre ud af fire hunde knoglemarv prøver indeholdt blodpropper, mens heldigvis størknet humane prøver (en i ti) var mindre hyppige. På den anden side var det ikke overraskende, at vi observeret meget lavere udbytter af MSC'er fra koagulerede prøver. For at løse tilbagevendende spørgsmål om koagulerede prøver, vi har udviklet protokollen ved hjælp af trombolytisk lægemiddel urokinase stedet for resampling.
Thrombolytiske terapier kan modvirke livstruende situationer såsom okklusion af blodkar forårsager hjerteanfald, slagtilfælde eller embolier grund af uønsket koagulation. De virker ved nedbrydning af blodpropper ved enzymatisk spaltning af fibrin med plasmin og enzymatisk plasminogenaktivatorer. På trods af den udbredte anvendelse til behandling af patienter, der findes kun ganske få publikationer, udnyttet thrombolytiske aktivitetertil laboratoriebrug at redde koagulerede prøver, for det meste med fokus på lymfocytter. I 1987 Niku et al. beskrev brugen af streptokinase for at opløse blodpropper resulterer i funktionelle lymfocytter 13 og fire år senere, de Vis et al. udvidet anvendelse af streptokinase at isolere leukæmiceller fra blod og knoglemarv til flowcytometrisk applikationer 14. En nyere publikation foreslår anvendelsen af Alteplase for kræftdiagnostik 15. Mens du bruger den samme enzymatiske metode, vores protokol fokuserer på isoleringen af multipotent MSC'er formular knoglemarv til at give et værktøj til forskere på området stamcelle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Menneske knoglemarvsaspirater fra hoftebenskammen blev indsamlet fra samtykkende donorer med godkendelse fra den etiske komité for kantonen Luzern. Canine knoglemarvsaspirater fra hoftebensranden blev opsamlet med hund ejerens consent.Human (ca.. 20 ml) og hunde (ca.. 10 ml) knoglemarvsaspirater var anti-koaguleret ved tilsætning af 15 ml 3,8% natriumcitrat umiddelbart efter tilbagetrækning i operationen teater. Prøverne blev overført til laboratoriet miljøet for behandling samme dag som trukket tilbage.
1. Fremstilling af Urokinase (Før 1. Brug)
- Rekonstituer urokinase anvendelse af sterilt phosphatbufret saltvand (PBS) i overensstemmelse med producentens instruktioner: Tilsæt 10 ml PBS til septum-indløb kolbe under anvendelse af en 10 ml sprøjte. Tørstoffet Opløs ved hvirvlende at opnå 50.000 injektion enheder (U) per ml.
- Forbered 500 pi alikvoter (25.000 U hver) i sterile rør. Store portioner -20 ° C, og bruge det, når det kræves i mindst 6 måneder.
2. Præparative Steps (Før hver knoglemarv behandling)
- Optø en alikvot af urokinase (25.000 U) pr størknet knoglemarvsaspirat (Aspirer mængder op til 25 ml er blevet behandlet med succes ved anvendelse af en enkelt portion af 25.000 U).
- Forvarm et vandbad eller rysteinkubator til 37 ° C.
3. Enzymatisk Digest af Clot
- Udfør alt arbejde i en laminar strømning biosikkerhed kabinet for at undgå mikrobiel kontaminering af knoglemarvsprøver under behandlingen. Når du arbejder med potentielt smittefarligt humant materiale, er brugen af beskyttelseshandsker samt omhyggelig behandling tilrådes.
- Placer en 100 um cellefilter oven af en steril 50 ml rør. Hæld forsigtigt knoglemarvsaspiratet gennem cellefilter, vippe si eller bevæger sig rundt blodproppen materiale. Brug en steril pipette tip tilbedre strømning gennem filtermaskevævet.
BEMÆRK: Undgå enhver udvanding af blodprop, fx ved at vaske blodprop med PBS. Urokinase virker indirekte og kræver komponenter i serum (dvs.., Plasminogen) fra biopsi for effektiv fordøjelse. Samtidig med proceduren med blodprop materiale, kan filtratet holdes ved stuetemperatur indtil videre anvendelse i trin 3.6. - Overfør knoglemarven blodprop materiale ind i en tom celle dyrkningsskål med sterile pincetter. Skær snavs i små stykker på ca. 2 mm 3 under anvendelse af en steril skalpel.
- Overfør små stykker af blodprop i et 50 ml reagensglas ved hjælp af sterile pincetter. Sørg for, at hakket blodprop har en våd udseende. Hvis det ser ud til at være tør, bruge nogle af filtratet fra trin 3.1 at fugte.
- Tritureres blodproppen ved pipettering op og ned 5 gange med 5 ml mikrotiter pipette. Tilsæt 1 portion af urokinase til prøven. Inkuber i 30 minutter ved 37 ° C enten i et vandbad eller ien omrystning (forsigtigt) inkubator.
- Tritureres ved pipettering op og ned 5 gange under anvendelse af en 5 ml pipette. Udfør dette trin i en biosikkerhed kabinet. Inkuber i yderligere 30 minutter ved 37 ° C. Efter inkubationen tritureres igen 5 gange med en 5 ml pipette. Pass over en frisk 100 um cellefilter til pool med filtratet fra trin 3.2.
- Centrifugeres cellesuspensionen ved stuetemperatur i 10 minutter ved 500 x g. Supernatanten fjernes. Re-suspendere cellepelleten i medier, som beskrevet nedenfor, eller i henhold til den normale procedure for dit laboratorium for MSC ekspansion kultur.
4. Såning for Expansion Cell Culture og CFU Platter
- Resuspender cellerne (bestående af erytrocytter og mononukleære celler) i 50 ml af basal medium: Alpha-MEM suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 U / ml penicillin, 100 mg / ml streptomycin og 2,5 mg / ml amphotericin B . Tæl cellerne fortyndet 1:10 i trypanblåt løsning med en Neubauer chamber.
- Plate cellerne i cellekultur kolber på densitet på 5 x 10 7 celler / cm2 og inkuberes i en befugtet inkubator ved 37 ° C. Hvis det er muligt, skal du bruge hypoxiske (5% ilt) forhold. For CFU assay kontrol pladen 10 9 celler i en cellekultur skål 10 cm diameter.
- Efter 3 dages dyrkning, er mesenchymstamceller fastgjort til celledyrkningsskål mens andre celler forbliver i suspension. Skift medier med basalt medium suppleret med 5 ng / ml basisk fibroblast vækstfaktor (bFGF). For CFU assay kontrol behandle celledyrkningsskål ligeledes.
- Fortsæt cellekultur for alt 2 uger udveksle medier tre gange om ugen. Hvis celler overstige 80% konfluens, opdelt ved trypsinisering. For CFU assay kontrol, udveksle medierne ligeledes, men ikke opdele cellerne i løbet af de to uger.
5. Giemsa Stain for CFU assay
- Forbered 10 ml Giemsa-opløsning pr skål: dilute stamopløsningen (7,6 g / l Giemsa i glycerol: methanol) 1:10 i sterilt vand (altid udarbejde en frisk arbejdsgruppe fortynding).
- Fjern mediet fra cellekulturen skålen og vask af cellerne med PBS. Være meget forsigtige, når de anvender væske til petriskålen og undgå afvaskning cellerne.
- Fix celler i ren methanol i 5 minutter ved stuetemperatur. Kassér methanol. Tilsæt Giemsa-opløsning og inkuberes i 60 minutter i en befugtet inkubator ved 37 ° C.
- Vask to gange med PBS. Luft tørre pladen hovedet først på et stykke køkkenrulle. Kolonierne manuelt. Dette opnås bedst ved en tusch på bagsiden af pladen.
6. MSC Differentiering
- Canine MSC'er differentiering
BEMÆRK: Canine MSC'er differentieret i chondrogen, osteogene og adipogeniske slægter ved stimulering med det ønskede medie i fire uger. - For Adipogeniske differentiering, kultur MSC'er i monolag ved 4 x 10 5 ceLLS / cm2 skiftevis to forskellige dyrkningsbetingelser som følger;
- Kultur i adipogenese vedligeholdelse medier indeholdende DMEM + GlutaMAX, 3% FBS, 100 enheder / ml penicillin, 100 mg / ml streptomycin, 2,5 ug / ml amphotericin B og 170 mM insulin.
- Kultur i adipogenese inducerende medier med vedligeholdelse medium suppleret med 3% FBS, 5% kaninserum, 1 uM dexamethason, 500 uM 3-isobutyl-1-methylxanthin, 33 uM biotin, 5 uM rosiglitazon og 17 uM pantothenat 16.
- Revel lipid dråber ved farvning med Oil Red-O. Kort fortalt fix celler med 10% formaldehyd, vask med PBS og plette med 0,35% Oil red O i isopropanol.
- For Osteogen differentiering kultur MSC'er i monolag på 7 x 10 3 celler / cm2 og stimulere i det følgende:
- Advanced DMEM (GIBCO) + GlutaMAX, 5% FBS, 100 enheder / ml penicillin, 100 mg / ml streptomycin, 2,5 ug / ml amphotericin B, 501 M L-ascorbinsyre-2-phosphat, 10 mM ß-glycerophosphat og 100 nM dexamethason.
- Identificer mineraliseringen indskud fra Von Kossa plet (5% AgNO3). Kort fortalt fikseres cellerne med 10% formaldehyd, vaskes med PBS og pletten med 5% AgNO3 i destilleret vand.
- Chondrogen differentiering
- Cut terninger (3 mm i hver side) fra en svamp formet medicinsk anordning, udgjorde fra lyofiliserede collagen type I og anvendes som stillads materiale til at understøtte celler 17.
- Seed MSC'er på toppen af terninger i en koncentration på 4 x 10 6 celler / ml (~ 70.000 celler / terning).
- Forud for tilsætning af medierne, tillade cellerne at klæbe til kuberne i 30 minutter.
- Oprethold MSC-kollagenkonstruktioner i chondrogen medier bestående af DMEM / F12 + GlutaMAX, 2,5% FBS, 100 enheder / ml penicillin, 100 mg / ml streptomycin, 2,5 ug / ml amphotericin B, 40 ng / ml dexamethason, 50 ug / ml ascorbinsyre -2-phosphat,50 ug / ml L-prolin, 1x Insulin-Transferrin-Selenium X, og 10 ng / ml transformerende vækstfaktor-β1.
- Brug Alcian blå farvning at visualisere akkumulation af proteoglycaner i konstruktioner sektioner. Kort fortalt, bejdse afsnittene O / N med 0,4% Alcian blå opløst i 0,01% H 2 SO 4 og 0,5 M guanidinhydrochlorid. Derefter blev vaske sektionerne vasket i 30 minutter i 40% DMSO og 0,05M MgCl2. Celler blev modfarvet med nuklear hurtig rød.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kendsgerningerne, at 74% af hunde knoglemarvsprøver (n = 54), der er indeholdt blodpropper, når de ankom i vores laboratorium (figur 1A) sammen med nedsat MSC udbytterne fra disse prøver, gjort os mener, at et betydeligt antal MSC'er var fanget inden for de blodpropper . Faktisk en simpel DAPI-farvning af snit blodprop materiale bekræfter tilstedeværelsen af kerneholdige celler i høj densitet (figur 1B). Dette fører i sidste ende til et lavt antal MSC'er rådighed for ekspansion kultur, der udløste os at udvikle protokollen hjælp urokinase. Typisk blodpropper forsvinder næsten helt, når de anvender vores protokol. Under metodeudvikling vi behandlet imidlertid spørgsmålet om blodprop fordøje systematisk ved vejning før og efter fordøjelse. Disse forsøg viste, at de ufordøjede rester var 15% (hund) eller 9% (human) af den oprindelige koagel vægt (figur 2A).
Et typisk træk ved knoglemarv MSC'er er enheden for at holde sig til cellekultur retter. Forskere gør brug af denne egenskab til at vælge for MSC. Som en konsekvens, en kolonidannende assay muligt at evaluere kvaliteten af cellen pool i en enkel, kvantitativ og pålidelig måde. I vores laboratorium har kolonidannende assay beskrevet heri blevet anvendt rutinemæssigt til alle knoglemarv prøver behandlet (også ikke-koagulerede dem). Dette tilladt os at bruge analysen som vigtigste kriterium for at fastslå effektiviteten af urokinase Digest. For at muliggøre direkte sammenligning celler fra størknet prøve filtrater (dvs. som om koagulerede prøver blot blev filtreret, men ikke enzymatisk behandlet) og fordøjet blodpropper blev podet på separate 10 cm skåle efterfulgt af inkubation i to uger. Når visualisere kolonidannende enheder (CFU) med Giemsa farve (som vist i figur 2B), observerede vi 3,8 gange mere CFU fra urokinase reaktioner hunde prøver end fra de tilsvarende indledende filtrater (figur 2C). Althdybdegående mindre fremtrædende, humane prøver fulgte en lignende tendens med 1,6 gange mere CFU fra behandlede prøver, bekræfter egnetheden af protokollen. Faktisk plader fordøjet blodprop illustreret i den højre række i figur 2B svarer til typisk resultat set en poolet prøve. Dog kan donor variation nemt resultere i CFU-numre fra en halv til det dobbelte af, hvad er afbildet.
Tager koloni-størrelse som indikator for celle pool kvalitet, mere medium (2-5 mm) og store (> 5 mm) kolonier fremkom på pladerne podet fra blodpropper i forhold til CFU fra filtrater (figur 2C). Dette indikerer generelt, at MSC'er vokse normalt efter urokinase behandling. Også i den samlede, sammenligningen af fordøjede hunde prøver (n = 21) til prøver uden at størkne (n = 7) gav sammenlignelige antal samlede MSC'er for behandlede prøver, selv om en stor inter-prøve variation, hvilket skyldes den heterogene donor befolkning (Figur2D).
Som en sidste funktionstest af egnethed, vi inducerede differentiering af MSC'er afledt af fordøjet knoglemarvsprøver. Ansøgninger i autologe stamceller er baseret på MSC differentiering til brusk, knogle eller fedtvæv eller MSC Parakrin signalering 18. Celler kan styres mod den ønskede vej differentiering ved at vælge de passende dyrkningsbetingelser for adipogenisk differentiering 19, osteogen differentiering 20 eller chondrogen afstamning 17. Derfor sammenlignede vi MSC'er fra knoglemarv koagel til MSC'er afledt fra unclotted knoglemarv prøve. Efter fire uger i kultur, var det muligt at skelne MSC'er i alle tre ovennævnte slægter. Dette blev histologisk testet med Von Kossa (for osteogen afstamning), Oil Red O (adipogenisk) og Alcian blå (chondrogene) farvninger, der viser ingen forskelle i graden af differentiering mellem grupperne ( 
Figur 1. Knoglemarvsceller blodpropper. Andel af hunde og human knoglemarv prøver i delvis størknet tilstand ved ankomsten (A). Vi fandt desuden, at MSC udbytter fra koagulerede prøver var stærkt reduceret på grund af et stort antal celler, der er fanget inden for de blodpropper. Et stort antal kerneholdige celler er til stede inden for blodpropper som påvist af DAPI-farvning af en kryosektion fra en hund knoglemarv blodprop (B). Scale bar repræsenterer 200 um. 
Figur 2. Isolering af MSC fra knoglemarv blodpropper fordøjet med urokinase. (A) Typisk knoglemarv blodpropper forsvinder næsten fuldstændigt ved urokinase Digest.Ved metode udvikling, vi vurderet blodprop vægte for hunde (n = 5, middelværdi ± SD, ** p ≤0.01) og humane prøver (n = 3, middelværdi ± SD, ns = ikke signifikant p = 0,10), der var stærkt reduceret ved urokinase Digest. (B) En simpel CFU-analysen kan tjene som en informativ værktøj til vurdering af kvaliteten af en MSC præparat. For at vurdere effektiviteten af fordøjelsen blev CFU assay udført for filtrater og fordøjet blodpropper fra knoglemarvsaspirater separat. Efter to uger i kultur blev 10 cm styrepladerne farvet med Giemsa og CFU blev talt. Assayet bekræftede, at et stort antal af CFU kan frigøres fra koagulatet ved urokinase fordøje og forblive funktionelle. Dette bekræftes også af den høje frekvens af store kolonier (klasse-division:.> 5 mm i sort, 2-5 mm i mørk grå og <2 mm i lysegrå Fejlsøjler repræsenterer SD af total CFU (n = 5 for hunde , n = 3 for menneskelige, ** p ≤0.01, ns = ikke signifikant, p = 0,17). (C) Billedes fra Giemsa-farvede plader bekræfter resultaterne vist. De viste for fordøjet blodprop plader svarer til et typisk resultat for en fordøjet knoglemarv prøve - men tal kan variere afhængigt af donor variabilitet. (D) I summen, anvendelse af urokinase fordøje protokol (n = 21) resulterer i sammenlignelige samlede MSC udbytter efter ekspansion kultur til naturligt blodprop gratis prøver (n = 7, gennemsnit ± SD). Statistisk analyse for hele figur 2 blev udført under anvendelse af Student t-test. 
Figur 3. Sammenligning af differentiering potentiale fordøjet versus indbygget unclotted prøver. Canine MSC'er isoleret fra størknet knoglemarv behandlet med Urokinase (øverste række) og unclotted knoglemarv (nederste række) blev differentieret i osteogen fænotype og farves af Von Kossa (bar =200 um) blev adipogeniske fænotype farvet med Oil Red O (bar = 100 um, i mellemværker større forstørrelse af fedt vakuoler), mens chondrogenese blev afsløret ved Alcian blå farvning (bar = 100 um; modfarvning nuklear hurtig rød). Klik her for at se en større udgave af dette tal .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Rutinemæssigt vi prøve knoglemarv, mens patienten er i kirurgi (i vores tilfælde hovedsagelig rygkirurgi), med den fordel, at kun lidt ekstra arbejde der skal udføres af personalet i driften teater. Selvom prøverne blandes med natriumcitrat umiddelbart efter tilbagetrækningen, mange prøver var delvis størknet, da de ankom i laboratoriet til forarbejdning. På dette stadium, vil resampling at erstatte koagulerede prøver være en separat ekstra indgreb nødvendiggør igen lokale eller generelle anæstesi 6. Det kræver vilje både det kliniske personale og donor til at bidrage og bruger en masse ressourcer 21.
Her giver vi en protokol, der bruger rekombinant humant urokinase på størknet knoglemarvsprøver at isolere multipotente MSC. Vi kunne påvise, at urokinase behandling ikke skader cellernes differentiering bevares. Protokollener kort, da det forlænger prøve behandling kun med ca. 1 ½ time i forhold til unclotted prøver samtidig giver sammenlignelige celle puljer. Hidtil er denne protokol blevet anvendt med succes på knoglemarv blodpropper fra forskellige individer og hunde ved hjælp af urokinase fra flere partier, og har vist robust og reproducerbar succes. Bortset fra dette, urokinase virker indirekte via aktivering af prøve-iboende plasminogen. Dette indebærer, at urokinase reaktion kræver plasma-miljø. Det er derfor tilrådeligt at indføre trin blodprop skylning eller lignende med fx PBS. Dette vil fortynde serum miljø og føre til en betydelig nedgang i den enzymatiske reaktion.
Beslutningen om at anvende urokinase for vores metode og ikke en anden thrombolytisk lægemiddel var triviel: vi udviklet protokol baseret på det thrombolytiske lægemiddel let tilgængelige i vores hospital apotek. For andre forskergrupper kan det derfor være lettere at bruge et væv-type plasminogen aktivator (dvs.., et andet lægemiddel produkt som alteplase, reteplase eller tenecteplase) hvis urokinase er ikke tilgængelig. Der er imidlertid potentielt vigtige forskelle mellem stoffer: modsætning vævstype-plasminogenaktivatorer kan urokinase udløse celleaktivering og proliferation, når bundet til urokinase-plasminogen-aktivator-receptor (uPAR) 22. Ved binding, er intracellulære signalering kaskader aktiveret som fører til celle migration og proliferation. I en fysiologisk situation, dette understøttes yderligere af udskillelsen af matrixmetalloproteinaser af aktiverede celler. Men i vores system, er urokinase fortyndes og gradvist fjernet ved ekspansion kultur uden at vise skadelige virkninger. Stadig med hensyn til den tilsigtede anvendelse af isolerede MSC'er, egnetheden af enhver af de thrombolytiske lægemidler skal bestemmes individuelt.
Generelt er høje doser for hurtig og fuldstændig blodprop digest anbefales af minimize uønsket markering under blodprop forarbejdning. Bemærkelsesværdige, mange tidligere undersøgelser anvendt bakteriel streptokinase til fordøje blod og knoglemarv blodpropper 13,14. Imidlertid kan dette stof provokere uønsket aktivering og reaktion af immunsystemet, hvilket kan være en væsentlig ulempe, især når anvendelse af celler til patienter er beregnet til.
Vi mener derfor, at vores protokol ikke kun hjælpe forskere og læger til at spare tid og reducere omkostningerne. Brug af urokinase - et godkendt enzymatisk lægemiddel uden kendt antigenicitet - måske endda give et værdifuldt redskab for mange translationelle forskningslaboratorier sigte på terapeutisk anvendelse af MSC præparater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Basal Medium Components | |||
| PenStrep 100X | Gibco | 15140122 | |
| Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| MEM Alpha w/ Nucleoside, w/ stable Glutamine | Amimed | 1-23S50-I | |
| FBS Heat Inactivated | Amimed | 2-01F36-I | |
| Amphotericin B | Applichem | A1907 | |
| Adipogenic Medium Components | |||
| DMEM-HAM F12 + GlutaMAX | Amimed | 1-26F09-I | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| Rabbit serum | Gibco | 16120099 | |
| Dexamethasone | Applichem | D4902 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma | I5879 | |
| Biotin | Sigma | B4639 | |
| Rosiglitazone | Sigma | R2408 | |
| Pantothenate | Sigma | P5155 | |
| Oil Red-O | Sigma | O0625 | |
| Osteogenic Medium Components | |||
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | |
| ß-glycerophosphate | Sigma | G9422 | |
| Silver nitrate (AgNO3) | Sigma | S6506 | |
| Chondrogenic Medium Components | |||
| Biopad - sponge shaped medical device | Euroresearch | ||
| L-proline | Sigma | P5607 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium X | Gibco | 51500056 | |
| Human transforming growth factor-β1 | Peprotech | 100-21 | |
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A3157 | |
| Nuclear fast red | Sigma | N8002 | |
| Generic | |||
| Tri-Sodium citrate dihydrate | Applichem | A3901 | |
| PBS | Applichem | 964.9100 | |
| Urokinase | Medac | 1976826 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Gibco | 15400054 | |
| Giemsa stain | Applichem | A0885 | |
| Formaldehyde | Applichem | A0877 | |
| Sulfuric acid (H2SO4) | Applichem | A0655 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Applichem | A1584 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Applichem | A3618 | |
| Guanidine hydrochloride | Applichem | A1499 | |
| Consumables | |||
| 50 ml reaction tube | Axygen | SCT-50ML-25-S | |
| 10 ml syringe | Braun | 4606108V | |
| Sterican needle (22G) | Braun | 4657624 | |
| 1.7 ml Microtubes | Brunschwig | MCT-175-C | |
| 100 μm cell strainer | Falcon | 6.05935 | |
| sterile forceps | Bastos Viegas, SA | 489-001 | |
| sterile scalpel | Braun | 5518059 | |
| Primaria cell cuture dish | Falcon | 353803 | |
| C-Chip Neubauer Improved | Bioswisstech | 505050 | |
| cell culture flask - Flask T300 | TPP | 90301 | |
| Equipment | |||
| Microbiological biosafety cabinet class II | Skan | 82011500 | |
| water bath | Memmert | 1305.0377 | |
| Stripettes Serological Pipette 5ml | Corning | 4487-200ea | |
| microscope | Olympus | CKX41 | |
| humidified incubator Heracells 240 | Thermo scientific | 51026331 | |
| Heraeus Multifuge 1S-R | Thermo scientific | 75004331 |
References
- Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418 (6893), 41-49 (2002).
- Uccelli, A., Moretta, L., Pistoia, V. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nat Rev Immunol. 8 (9), 726-736 (2008).
- Bartholomew, A., et al. Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo. Exp Hematol. 30 (1), 42-48 (2002).
- Wang, S., Qu, X., Zhao, R. C. Clinical applications of mesenchymal stem cells. J Hematol Oncol. 5, 19 (2012).
- Baksh, D., Song, L., Tuan, R. S. Adult mesenchymal stem cells: characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy. J Cell Mol Med. 8 (3), 301-316 (2004).
- Malempati, S., Joshi, S., Lai, S., Braner, D. A., Tegtmeyer, K. Videos in clinical medicine. Bone marrow aspiration and biopsy. N Engl J Med. 361 (15), e28 (2009).
- Cuthbert, R., et al. Single-platform quality control assay to quantify multipotential stromal cells in bone marrow aspirates prior to bulk manufacture or direct therapeutic use. Cytotherapy. 14 (4), 431-440 (2012).
- Veyrat-Masson, R., et al. Mesenchymal content of fresh bone marrow: a proposed quality control method for cell therapy. Br J Haematol. 139 (2), 312-320 (2007).
- Lazarus, H. M., Haynesworth, S. E., Gerson, S. L., Rosenthal, N. S., Caplan, A. I. Ex vivo expansion and subsequent infusion of human bone marrow-derived stromal progenitor cells (mesenchymal progenitor cells): implications for therapeutic use. Bone Marrow Transplant. 16 (4), 557-564 (1995).
- Bertolo, A., et al. An in vitro expansion score for tissue-engineering applications with human bone marrow-derived mesenchymal stem cells. J Tissue Eng Regen Med. , (2013).
- Casiraghi, F., Remuzzi, G., Abbate, M., Perico, N. Multipotent mesenchymal stromal cell therapy and risk of malignancies. Stem Cell Rev. 9 (1), 65-79 (2013).
- Bonab, M. M., et al. Aging of mesenchymal stem cell in vitro. BMC Cell Biol. 7, 14 (2006).
- Niku, S. D., Hoon, D. S., Cochran, A. J., Morton, D. L. Isolation of lymphocytes from clotted blood. J Immunol Methods. 105 (1), 9-14 (1987).
- De Vis, J., Renmans, W., Segers, E., Jochmans, K., De Waele, M. Flow cytometric immunophenotyping of leukemia cells in clotted blood and bone marrow. J Immunol Methods. 137 (2), 193-197 (1991).
- St Antoine, A., et al. Application of thrombolytic drugs on clotted blood and bone marrow specimens to generate usable cells for cytogenetic analyses. Arch Pathol Lab Med. 135 (7), 915-919 (2011).
- Kisiel, A. H., et al. Isolation, characterization, and in vitro proliferation of canine mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose tissue, muscle, and periosteum. Am J Vet Res. 73 (8), 1305-1317 (2012).
- Bertolo, A., et al. Influence of different commercial scaffolds on the in vitro differentiation of human mesenchymal stem cells to nucleus pulposus-like cells. Eur Spine J. 21, Suppl 6. S826-S838 (2012).
- Makridakis, M., Roubelakis, M. G., Vlahou, A. Stem cells: insights into the secretome. Biochim Biophys Acta. 1834 (11), 2380-2384 (2013).
- Benvenuti, S., et al. Rosiglitazone stimulates adipogenesis and decreases osteoblastogenesis in human mesenchymal stem cells. J Endocrinol Invest. 30 (9), RC26-RC30 (2007).
- Jaiswal, N., Haynesworth, S. E., Caplan, A. I., Bruder, S. P. Osteogenic differentiation of purified, culture-expanded human mesenchymal stem cells in vitro. J Cell Biochem. 64 (2), 295-312 (1997).
- Patel, A. Tissue banking for research--bench to bedside and back--myth, reality or fast fading reality at the dawn of a personalised healthcare era. Cell Tissue Bank. 12 (1), 19-21 (2011).
- Smith, H. W., Marshall, C. J. Regulation of cell signalling by uPAR. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (1), 23-36 (2010).
