التصوير ثنائي الفوتون من الكالسيوم داخل الخلايا<sup> 2+</sup> المناولة واكسيد النيتريك الإنتاج في البطانية وخلايا العضلات الملساء لعزل الجرذ الأبهر
Summary
Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.
Abstract
الكالسيوم هو منظم هام جدا من العديد من العمليات الفسيولوجية في الأنسجة الوعائية. معظم البطانية والعضلات الملساء وظائف تعتمد إلى حد كبير على التغيرات في الكالسيوم داخل الخلايا ([كا 2+] ط) وأكسيد النيتريك (NO). من أجل فهم كيف [كا 2+] ط، NO ويتم التعامل مع جزيئات المصب بواسطة أحد الأوعية الدموية في استجابة لvasoconstrictors وموسعات، قمنا بتطوير تقنية جديدة أن ينطبق الكالسيوم وضع العلامات (أو NO-التوسيم) الأصباغ مع اثنين من الفوتون المجهري لقياس التعامل مع الكالسيوم (أو أي إنتاج) في الأوعية الدموية معزولة. وصف هنا هو خطوة بخطوة الإجراء الموضح الذي يوضح كيفية عزل والشريان الأورطي من الفئران، الكالسيوم التسمية أو NO داخل الخلايا البطانية أو العضلات الملساء، وصورة العابرين الكالسيوم (أو NO الإنتاج) باستخدام مجهر اثنين من الفوتون التالية الفسيولوجية أو المنبهات الدوائية. فوائد استخدام طريقة هي متعددة جوانب: 1) أنه من الممكن في وقت واحدلاي قياس العابرين الكالسيوم في كل من الخلايا البطانية وخلايا العضلات الملساء في استجابة للمؤثرات مختلفة؛ 2) أنه يسمح احد لخلايا صورة البطانية وخلايا العضلات الملساء في بيئتها. 3) هذه الطريقة هي حساسة جدا للكالسيوم داخل الخلايا أو NO التغييرات ويولد صور عالية الدقة لقياسات دقيقة. و4) نهج صفها يمكن تطبيقها على قياس الجزيئات الأخرى، مثل أنواع الاكسجين التفاعلية. باختصار، تطبيق اثنين من الفوتون المجهري انبعاث الليزر لمراقبة العابرين الكالسيوم وNO الإنتاج في البطانية وخلايا العضلات الملساء في الأوعية الدموية ومعزولة قدمت بيانات كمية عالية الجودة والترويج فهمنا للآليات تنظيم وظيفة الأوعية الدموية.
Introduction
الكالسيوم هو رسول الثاني الأساسي داخل الخلايا الوعائية مثل البطانية وخلايا العضلات الملساء. هو الحافز الأساسي لتقلص الأوعية الدموية، ويلعب دورا رئيسيا في توسع الأوعية الدموية، بما في ذلك آثاره من خلال NO جيل داخل البطانة. بسبب القيود المفروضة على تقنيات التصوير، فقد كان من المستحيل تقريبا لمراقبة التعامل مع الكالسيوم داخل السفينة سليمة. تطوير نظامين التصوير فوتون وإنشاء الكالسيوم جديد أو NO الأصباغ وضع العلامات، ويجعل من الممكن لصورة على عمق ودقة كافية للبدء في فهم ديناميات الكالسيوم وNO الإنتاج داخل الأوعية الدموية.
وقد تم مؤخرا تطبيق اثنين من الفوتون المجهري في الأنسجة والأجهزة والدراسات على الحيوانات حتى بأكملها بسبب القدرة الفائقة لاختراق عميق الأنسجة مع انخفاض مضان الخلفية وحساسية إشارة عالية 1،2 الطيف ضيق اثنين من الفوتون الإثارة في illuminatأيون نقطة اتصال واستخدام أجهزة كشف غير descanned هي الأسباب التي دفعت اثنين من الفوتون المجهري متفوقة على المجهر متحد البؤر التقليدية. المجهر متحد البؤر لا يمكن أن تنتج صورا ذات جودة عالية في عمق الأنسجة ضروري نظرا لصناعة السيارات في مضان ونثر من خارج التركيز الضوء في الثقب متحد البؤر. ونتيجة لذلك، قمنا بتطوير طريقة استخدام المجهر اثنين الفوتون لقياس [كا 2+] ط الإشارات وNO الإنتاج في حالها، الفردية خلايا الأوعية الدموية مع ارتفاع القرار، ونسبة منخفضة إشارة إلى الضجيج.
Protocol
Representative Results
Discussion
نظرة عامة التجريبية. لفهم أفضل للمساهمة الكالسيوم وNO لعلم وظائف الأعضاء الأوعية الدموية، وقد تم تطوير طريقة جديدة لقياس [كا 2+] أنا وNO داخل العضلات الملساء والخلايا البطانية من aortas سليمة معزولة. معا، ويتكون هذا البروتوكول من هذه الخطوات الحاسمة: 1) عزل…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتور ويليام Cashdollar، ومركز نورث وسترن المتبادلة التصوير مؤسسة في معهد أبحاث الدم ويسكونسن للمساعدة في الدراسات التصوير. كما نشكر الدكتور داريا Ilatovskaya لقراءة نقدية لهذه المخطوطة ومناقشة مفيدة. وأيد هذه الدراسة من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح HL108880 (لAS) وDP2-OD008396 (لAMG).
Materials
| DAF-FM | Life Technologies | D-23842 | |
| Fluo 4 AM | Life Technologies | F14217 | 500µl in DMSO |
| Pluronic F-68 solution | Sigma-Aldrich | P5556 | |
| L-Name | Tocris | 0665 | |
| Olympus upright microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | |
| MaiTai HP DeepSee-OL | Spectra Physics | Ti:sapphire laser 690nm — 1040nm | |
| Filters | Olympus | FV10-MRL/R | 495 to 540 nm |
| 25× water-immersion objective lens | Olympus | XLPL25XWMP | N.A. 1.05 and working distance 2 mm |
| Slice Anchor grid | Warner Instrument | SHD-27LH | |
| Other basic reagents | Sigma-Aldrich |
Referências
- Molitoris, B. A. Using 2-photon microscopy to understand albuminuria. Trans. Am. Clin. Climatol. Assoc. 125, 343-357 (2014).
- Burford, J. L., et al. Intravital imaging of podocyte calcium in glomerular injury and disease. J. Clin. Invest. 124, 2050-2058 (2014).
- Palygin, O., et al. Real-time electrochemical detection of ATP and H(2)O(2) release in freshly isolated kidneys. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 305, F134-F141 (2013).
- Ilatovskaya, D. V., et al. Single-channel analysis and calcium imaging in the podocytes of the freshly isolated. J Vis. Exp. In Press, (2015).
- Zhu, J., et al. Role of superoxide and angiotensin II suppression in salt-induced changes in endothelial Ca2+ signaling and NO production in rat aorta. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 291, H929-H938 (2006).
- Endres, B. T., et al. Mutation of Plekha7 attenuates salt-sensitive hypertension in the rat. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 12817-12822 (2014).
- Williams, D. A., Fogarty, K. E., Tsien, R. Y., Fay, F. S. Calcium gradients in single smooth muscle cells revealed by the digital imaging microscope using Fura-2. Nature. 318, 558-561 (1985).
- Mansfield, J., et al. The elastin network: its relationship with collagen and cells in articular cartilage as visualized by multiphoton microscopy. J. Anat. 215, 682-691 (2009).
- Sathanoori, R., et al. Shear stress modulates endothelial KLF2 through activation of P2X4. Purinergic Signal. 11, 139-153 (2015).
- Hall, A. M., Molitoris, B. A. Dynamic Multiphoton Microscopy: Focusing Light on Acute Kidney Injury. Physiology. 29, 334-342 (2014).
- Campese, V. M. Salt sensitivity in hypertension. Renal and cardiovascular implications. Hypertension. 23, 531-550 (1994).
- Cowley, A. W. Genetic and nongenetic determinants of salt sensitivity and blood pressure. Am. J. Clin. Nutr. 65, 587S-593S (1997).
- Flister, M. J., et al. Identification of hypertension susceptibility loci on rat chromosome 12. Hypertension. 60, 942-948 (2012).
- Flister, M. J., et al. Identifying multiple causative genes at a single GWAS locus. Genome Res. 23, 1996-2002 (2013).
- Mattson, D. L., et al. Genetic mutation of recombination activating gene 1 in Dahl salt-sensitive rats attenuates hypertension and renal damage. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 304, R407-R414 (2013).
- Rudemiller, N., et al. CD247 modulates blood pressure by altering T-lymphocyte infiltration in the kidney. Hypertension. 63, 559-564 (2014).
- Flister, M. J., et al. CXM – a new tool for mapping breast cancer risk in the tumor microenvironment. Cancer Res. 74, 6419-6429 (2014).
