Twee-foton Imaging van intracellulaire Ca<sup> 2+</sup> Behandeling en stikstofoxide productie in endotheelcellen en gladde spiercellen van een geïsoleerd Rat Aorta
Summary
Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.
Abstract
Calcium is een belangrijke regulator van veel fysiologische processen in vasculaire weefsels. De meeste endotheel- en gladde spier functies sterk afhankelijk van veranderingen in intracellulair calcium ([Ca2 +] i) en stikstofoxide (NO). Om te begrijpen hoe de [Ca 2+] i, NO en downstream moleculen worden behandeld door een bloedvat in reactie op vasoconstrictoren en vaatverwijders, ontwikkelden we een nieuwe techniek dat calcium-etikettering van toepassing is (of NO-etikettering) kleurstoffen met twee foton microscopie calcium handling (of NO-productie) in geïsoleerde bloedvaten te meten. Hier beschreven is een stap-voor-stap procedure die laat zien hoe een aorta te isoleren uit een rat, label calcium of NO in het endotheel of gladde spiercellen, en het beeld calcium transiënten (of NO-productie) met behulp van een twee-foton microscoop volgende fysiologische of farmacologische stimuli. De voordelen van de werkwijze zijn multi-fold: 1) Het is mogelijk om gelijktijdigely meten calcium transiënten in zowel endotheelcellen en gladde spiercellen in reactie op verschillende stimuli; 2) Het maakt het mogelijk om beeld endotheelcellen en gladde spiercellen in hun natieve omgeving; 3) Deze methode is zeer gevoelig voor intracellulair calcium of NO veranderingen en genereert hoge resolutiebeelden voor nauwkeurige metingen; en 4) beschreven benadering kan worden toegepast op de meting van andere moleculen, zoals reactieve zuurstofsoorten. Samengevat, de toepassing van twee foton laseremissie microscopie calcium transiënten en NO productie in de endotheel- en gladde spiercellen van een geïsoleerde bloedvat verschaft hoogwaardige kwantitatieve gegevens en bevorderd ons begrip van de mechanismen reguleren bloedvaten te controleren.
Introduction
Calcium is een essentiële tweede messenger in vasculaire cellen zoals endotheelcellen en gladde spiercellen. Het is de primaire stimulus voor vasculaire contractie en speelt een belangrijke rol bij vaatverwijding, inclusief de effecten bij NO productie in het endotheel. Door de beperkingen van beeldvormende technieken, is het vrijwel onmogelijk om calcium handling te observeren binnen de intacte vat. De ontwikkeling van twee foton imaging systemen en de creatie van nieuwe calcium of NO etikettering kleurstoffen, maakt het mogelijk om de afbeelding op een voldoende diepte en resolutie om te beginnen met calcium dynamiek en NO productie in het vaatstelsel te begrijpen.
Twee foton microscopie is onlangs toegepast in weefsels, organen en zelfs hele dierstudies vanwege zijn superieure vermogen om diep weefsels met lage achtergrond fluorescentie en hoge signaal gevoeligheid. 1,2 De smalle spectrum van twee foton excitatie bij het Illumination knooppunt en het gebruik van niet descanned detectors zijn de redenen waarom er twee foton microscopie superieur aan traditionele confocale microscopie. Confocale microscopie kan geen beelden van hoge kwaliteit op de nodige weefsel diepte te wijten aan de auto-fluorescentie en de verstrooiing van out-of-focus licht in de confocale pinhole. Daarom hebben we een methode waarbij twee foton microscoop te meten [Ca 2+] i signalerings- en NO productie in intacte individuele bloedvat cellen met een hoge resolutie en een lage signaal-ruisverhouding ontwikkeld.
Protocol
Representative Results
Discussion
Experimentele Overzicht. Om beter inzicht in de bijdrage van calcium en NO om vasculaire fysiologie, werd een nieuwe methode ontwikkeld voor het meten van [Ca 2+] i en NO binnen gladde spier en endotheelcellen van geïsoleerde intacte aorta. Samen Dit protocol omvat de volgende kritische stappen: 1) Mechanische isolatie en bereiding (niet enzymatische afbraak) van het vat. Het is belangrijk dat het weefsel gezond en intact zoveel mogelijk optimale fysiologische opname bekomen houden. 2) In…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Dr. William Cashdollar en de Northwestern Mutual Foundation Imaging Center op het Bloed Research Institute of Wisconsin voor hulp met de imaging studies. We danken ook Dr. Daria Ilatovskaya voor kritische lezing van dit manuscript en behulpzaam discussie. Deze studie werd ondersteund door de National Institutes of Health Subsidies HL108880 (AS) en DP2-OD008396 (AMG).
Materials
| DAF-FM | Life Technologies | D-23842 | |
| Fluo 4 AM | Life Technologies | F14217 | 500µl in DMSO |
| Pluronic F-68 solution | Sigma-Aldrich | P5556 | |
| L-Name | Tocris | 0665 | |
| Olympus upright microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | |
| MaiTai HP DeepSee-OL | Spectra Physics | Ti:sapphire laser 690nm — 1040nm | |
| Filters | Olympus | FV10-MRL/R | 495 to 540 nm |
| 25× water-immersion objective lens | Olympus | XLPL25XWMP | N.A. 1.05 and working distance 2 mm |
| Slice Anchor grid | Warner Instrument | SHD-27LH | |
| Other basic reagents | Sigma-Aldrich |
Referências
- Molitoris, B. A. Using 2-photon microscopy to understand albuminuria. Trans. Am. Clin. Climatol. Assoc. 125, 343-357 (2014).
- Burford, J. L., et al. Intravital imaging of podocyte calcium in glomerular injury and disease. J. Clin. Invest. 124, 2050-2058 (2014).
- Palygin, O., et al. Real-time electrochemical detection of ATP and H(2)O(2) release in freshly isolated kidneys. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 305, F134-F141 (2013).
- Ilatovskaya, D. V., et al. Single-channel analysis and calcium imaging in the podocytes of the freshly isolated. J Vis. Exp. In Press, (2015).
- Zhu, J., et al. Role of superoxide and angiotensin II suppression in salt-induced changes in endothelial Ca2+ signaling and NO production in rat aorta. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 291, H929-H938 (2006).
- Endres, B. T., et al. Mutation of Plekha7 attenuates salt-sensitive hypertension in the rat. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 12817-12822 (2014).
- Williams, D. A., Fogarty, K. E., Tsien, R. Y., Fay, F. S. Calcium gradients in single smooth muscle cells revealed by the digital imaging microscope using Fura-2. Nature. 318, 558-561 (1985).
- Mansfield, J., et al. The elastin network: its relationship with collagen and cells in articular cartilage as visualized by multiphoton microscopy. J. Anat. 215, 682-691 (2009).
- Sathanoori, R., et al. Shear stress modulates endothelial KLF2 through activation of P2X4. Purinergic Signal. 11, 139-153 (2015).
- Hall, A. M., Molitoris, B. A. Dynamic Multiphoton Microscopy: Focusing Light on Acute Kidney Injury. Physiology. 29, 334-342 (2014).
- Campese, V. M. Salt sensitivity in hypertension. Renal and cardiovascular implications. Hypertension. 23, 531-550 (1994).
- Cowley, A. W. Genetic and nongenetic determinants of salt sensitivity and blood pressure. Am. J. Clin. Nutr. 65, 587S-593S (1997).
- Flister, M. J., et al. Identification of hypertension susceptibility loci on rat chromosome 12. Hypertension. 60, 942-948 (2012).
- Flister, M. J., et al. Identifying multiple causative genes at a single GWAS locus. Genome Res. 23, 1996-2002 (2013).
- Mattson, D. L., et al. Genetic mutation of recombination activating gene 1 in Dahl salt-sensitive rats attenuates hypertension and renal damage. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 304, R407-R414 (2013).
- Rudemiller, N., et al. CD247 modulates blood pressure by altering T-lymphocyte infiltration in the kidney. Hypertension. 63, 559-564 (2014).
- Flister, M. J., et al. CXM – a new tool for mapping breast cancer risk in the tumor microenvironment. Cancer Res. 74, 6419-6429 (2014).
