세포 내 칼슘의 두 광자 이미징<sup> 2 +</sup> 고립 된 쥐 대동맥의 취급 및 내피 세포에서 산화 질소 생산과 부드러운 근육 세포
Summary
Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.
Abstract
칼슘은 혈관 조직에서 많은 생리적 과정의 중요한 레귤레이터이다. 대부분의 내피 세포와 평활근 기능이 높은 세포 내 칼슘 ([칼슘 2 +] I) 및 산화 질소 (NO)의 변화에 따라 달라집니다. 위해 두 광자 현미경 염료 [칼슘 2 +] 난, NO 및 다운 스트림 분자가 혈관 수 축제와 혈관 확장제에 대한 응답으로 혈관에 의해 처리됩니다, 우리는 칼슘 라벨을 적용하는 새로운 기술 (또는 라벨링)을 개발하는 방법을 이해하기 절연 혈관 칼슘 처리 (또는 NO 생산)을 측정 하였다. 여기에 설명 된 쥐, 라벨 칼슘 또는 NO 내피 세포 나 평활근 세포 내에서 대동맥을 분리, 이미지 칼슘 과도 (또는 생산) 생리적 다음 두 광자 현미경을 사용하는 방법을 보여줍니다 자세한 단계별 절차 또는 약물 학적 자극. 상기 방법을 사용하는 이점은 다중 겹 : 1)이 동시에 가능하다LY는 내피 세포와 다른 자극에 응답하여 평활근 세포 모두에서 칼슘 과도를 측정; 2) 화상 내피 세포와 그 나라의 설정에서 평활근 세포에 하나 허용; 3)이 방법은 세포 내 칼슘 또는 변경 및 정확한 측정을위한 고해상도 이미지를 생성에 매우 민감; 4) 기재 방법은 활성 산소와 같은 다른 분자의 측정에 적용 할 수있다. 요약하면, 두 개의 광자 레이저 발광 현미경의 적용은 칼슘 과도 및 절연 혈관 내피 세포 및 평활근 세포에서 NO 생산 고품질 정량적 데이터를 제공 및 혈관 기능을 조절 메커니즘에 대한 이해를 촉진하고있다을 모니터링한다.
Introduction
칼슘은 내피 및 평활근 세포, 혈관 등의 세포 내 메신저 근본적인 초이다. 이 혈관 수축 주 자극이고 내피 내의 NO 생성을 통해 그 효과를 포함하여, 혈관 확장술에서 중요한 역할을한다. 인해 영상 기술의 한계, 그것을 그대로 용기 내 칼슘 처리를 거의 관찰 할 수 없었다. 두 광자 이미징 시스템과 새로운 칼슘의 생성 또는 NO 표지 염료의 개발은, 칼슘 역학과 혈관 내의 NO 생성을 이해하기 시작하기에 충분한 깊이 해상도 이미지를 가능하게한다.
이광자 현미경 최근 조직, 기관 때문에 깊이 낮은 배경 형광 및 높은 신호 감도와 조직을 관통하는 뛰어난 능력에도 전체 동물 실험에 적용되어왔다. 1,2- 보조광 두 광자 여기의 좁은 스펙트럼이온 초점 비 descanned 검출기의 사용은 두 개의 광자 공 초점 현미경은 전통적인 현미경 우수 이유이다. 공 초점 현미경에 의한 자동 형광 공 촛점 핀홀에 포커스 아웃 광의 산란에 필요한 조직 깊이에 고품질 이미지를 생성 할 수 없다. 따라서, 우리는 [Ca를 2+] i가 시그널링 측정하는 이광자 현미경을 사용하는 방법 및 높은 해상도와 낮은 신호 – 대 – 잡음비와 그대로 개별 혈관 세포에서 NO 생산을 개발 하였다.
Protocol
Representative Results
Discussion
실험 개요. 더 나은 혈관 생리학에 아무 칼슘의 기여를 이해하고, 새로운 방법은 측정하기 위해 개발되었다 [칼슘 2 +] 나는 더 부드러운 근육과 고립 그대로 대동맥의 혈관 내피 세포 내에서. 1) 기계적 분리 및 준비 (효소되지 소화) 선박의 : 함께,이 프로토콜은 이러한 중요한 단계로 구성되어 있습니다. 이는 최적의 생리 녹음을 얻을 수만큼 건강한 조직을 그대로 유지하는…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 영상 검사에 대한 도움말 박사 윌리엄 Cashdollar, 위스콘신의 혈액 연구소의 노스 웨스턴 뮤추얼 재단 이미징 센터 감사합니다. 우리는 또한이 원고과 도움이 토론의 중요한 읽기 박사 다리아 Ilatovskaya 감사합니다. 이 연구는 (AS에) 건강 보조금 HL108880의 국립 연구소 및 (AMG에) DP2-OD008396에 의해 지원되었다.
Materials
| DAF-FM | Life Technologies | D-23842 | |
| Fluo 4 AM | Life Technologies | F14217 | 500µl in DMSO |
| Pluronic F-68 solution | Sigma-Aldrich | P5556 | |
| L-Name | Tocris | 0665 | |
| Olympus upright microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | |
| MaiTai HP DeepSee-OL | Spectra Physics | Ti:sapphire laser 690nm — 1040nm | |
| Filters | Olympus | FV10-MRL/R | 495 to 540 nm |
| 25× water-immersion objective lens | Olympus | XLPL25XWMP | N.A. 1.05 and working distance 2 mm |
| Slice Anchor grid | Warner Instrument | SHD-27LH | |
| Other basic reagents | Sigma-Aldrich |
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