Here the method to establish a syngeneic mouse model of orthotopic bladder tumour to evaluate the anti-tumour efficacy of the bacterial protein HP-NAP is described.
Bladder cancer is one of the most common malignancies of the urogenital tract. Intravesical injection of Bacillus Calmette-Guérin (BCG) is the gold standard treatment for the high-grade non-muscle invasive bladder cancer (NMIBC). However, since the treatment-related side effects are relevant, newer biological response modifiers with a better benefit/side effects ratio are needed.
The tumour microenvironment can influence both tumour development and therapy efficacy. In order to obtain a good model, it is desirable to implant tumour cells in the organ from which the cancer originates.
In this protocol, we describe a method for establishing a tumour in the bladder cavity of female mice and subsequent delivery of therapeutic agents; the latter are exemplified by our use of Helicobacter pylori neutrophil activating protein (HP-NAP). A preliminary chemical burn of the mucosa, followed by the injection of mouse urothelial carcinoma cell line MB49 via urethral catheterization, enables the cells to attach to the bladder mucosa. After a period, required to allow an initial proliferation of the cells, mice are treated with HP-NAP, administrated again via catheterization. The anti-tumour activity of HP-NAP is evaluated comparing the tumour volume, the extent of necrosis and the degree of vascularization between vehicle- and HP-NAP-treated animals.
Blaaskanker is een van de meest voorkomende kanker van het urogenitale kanaal, met ongeveer 75000 nieuwe gevallen per jaar in de Verenigde Staten 1. Hoge tarieven van herhaling vereisen levenslang follow-up, die blaaskanker een van de duurste vormen van kanker te behandelen maakt. De gouden standaard behandeling voor de high-grade NMIBC is trans-urethrale resectie, gevolgd door intravesicale immunotherapie met BCG. Hoewel het precieze mechanisme van de antitumoractiviteit van BCG nog niet geheel opgehelderd, wordt aangenomen dat de activering van een celgemedieerde immuunrespons verrijkte T helper (Th) 1 en cytotoxische T (Tc) 1 cellen is cruciaal voor het succes van de therapie 2.
Hoewel BCG blijft de voorkeursbehandeling voor NMIBC, een groot deel van de patiënten niet reageren op de therapie; Bovendien kan een aantal bijwerkingen veroorzaken: ongeveer 70% van de behandelde tumoren terugkeren na enige tijd en ~ 15% vooruitgang spier-invasieve vorm van hetziekte. Andere bijwerkingen van BCG behandeling omvatten dysurie, cystitis en nierontsteking 3-6.
De ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën moeten rekening houden met het gebruik van preklinische modellen, na de eerste in vitro evaluatie; Dit geldt met name voor tumoren waarvan micro aanzienlijk beïnvloeden de ontwikkeling en de gevoeligheid voor behandeling.
In de afgelopen tien jaar hebben we meerdere aspecten van het immuunsysteem modulerende activiteit van HP-NAP, een eiwit geproduceerd door de bacterie Helicobacter pylori aangepakt, aanvankelijk geïdentificeerd als in staat is het bevorderen van endotheel hechting van polymorfonucleaire cellen (PMN) 7. Structureel, HP-NAP behoort tot het DNA beschermt eiwit onder uitgehongerd omstandigheden (DPS) gezin 8 en bestaat uit 12 identieke subeenheden gerangschikt in een dodecameer schelp.
We hebben aangetoond dat HP-NAP isEen Toll-achtige receptor (TLR) 2 agonist, met een sterke immunomodulerende activiteit verantwoordelijk voor het stimuleren van de differentiatie van T-lymfocyten naar de Th1 fenotype, zowel in vitro als in vivo 9-10. Krachtens deze activiteit HP-NAP kan de Th2 immuunrespons in de gunstiger Th1 respons in een muismodel van allergische astma 11 omleiden.
Om de Th1-afhankelijke anti-tumor potentieel van HP-NAP te evalueren, hebben we geprofiteerd van een muismodel van blaaskanker ontwikkelde enkele jaren geleden door O'Donnel en collega's 12 voor het evalueren van de impact van de BCG administratie.
Met dit protocol, tonen we dat HP-NAP een sterke antitumor potentieel tegen blaaskanker en de werkzaamheid van HP-NAP toediening loopt parallel met de significante accumulatie in tumor en regionale lymfeknopen, zowel Th1- en Tc1-lymfocyten die interferon ( IFN) -γ 13 </sup>. Tumoren geïsoleerd van HP-NAP-behandelde muizen vertoonden meer necrose en minder vascularization dan de onbehandelde tegenhanger.
Het huidige rapport geeft een stepbystep protocol, waarin de voorbereiding van de dieren, hun urethrale catheterisatie, de chemische branden die nodig zijn voor de bevestiging van de cellen naar de blaas mucosa, en de injectie van de tumorcellen. We beschrijven ook de topische toediening van HP-NAP die kan worden beschouwd als een prototype van therapeutische middelen ontwikkeld voor de behandeling van blaaskanker. Het verkregen door het vergelijken tumoren geïsoleerd uit controle en HP-NAP-behandelde dieren aanwijzingen benadrukt niet alleen dat HP-NAP een goede kandidaat voor blaaskanker immunotherapie, maar ook de algemene doeltreffendheid van de proefmethoden zijn.
De meeste vooruitgang in kankertherapie nodig tests diermodellen voordat klinische trials. De mogelijkheid van het bestuderen van de tumor biologie in vivo, gebruik te maken van diermodellen, vormt een essentieel instrument voor onderzoekers onderzoeken kanker pathogenese, waardoor de beoordeling van de verschillende therapeutische benaderingen. Orthotope modellen blijven de gouden standaard 14-15, zowel vanwege de enorme hoeveelheid cellijnen die beschikbaar zijn voor het opzetten van een tumor mode…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro, Italiaanse ministerie van Universiteit en Researchcentrum, Prin projecten en Progetti di Ricerca di Ateneo, verlenen N ° CPDA137871, Fondazione Cariplo verlenen N ° 2011-0485 MDB, en door Finanziamento Giovani Studiosi, Universiteit van Padua, op Gaia Codolo.
Materials | |||
C57BL/6J female mice | Harlan Italy (Udine, Italy) | ||
MB49 Cells | Obtained from Prof. O'Donnel, University of Iowa Carver College of Medicine, Iowa, USA | ||
RPMI | Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) | R8758 | |
FBS | Sigma-Aldrich | F7524 | |
PBS | Sigma-Aldrich | D1408 | 10X, to be diluted in apyrogenic water |
Flask | Becton Dickinson (Franklin Lakes, New Jersey, USA) | 353135 | |
Syringe 1ml | Becton Dickinson | 301358 | |
Trypsin | Life Technologies (Waltham, Massachusetts, USA) | ||
Gentamycin | Life Technologies | 15710-049 | |
Xilor | Bio 98 s.r.l. (Milano, Italy) | 2% Xylazin | |
Zoletil | Virbac (Carros, France) | 359713301992 | 5% Zolazepam + 5% Tiletamine |
24G Catheter | Terumo (Rome, Italy) | SR+DM2419PX | |
HCl | Carlo Erba Reagents (Milano, Italy) | 403871 | Liquid |
NaOH | JT Baker (Center Valley, Pennsylvania, USA) | 10095011 | Powder |
Equipment | |||
Surgical Scalpel | Albion Surgical Limited (Sheffield, England) | ||
Microtome | Leica Microsystem ( Wetzlar, Germany) | RM2235 | |
Microscope Slides | VWR International (Radnor, Pennsylvania, USA) | 631-0108 | |
Image Analyzer | Zeiss (Jena, Germany) | Cyres System |
Materials C57BL/6J female mice Harlan Italy (Udine, Italy) MB49 Cells Obtained from Prof. O'Donnel, University of Iowa Carver College of Medicine, Iowa, USA RPMI Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) R8758 FBS Sigma-Aldrich F7524 PBS Sigma-Aldrich D1408 10X, to be diluted in apyrogenic water Flask Becton Dickinson (Franklin Lakes, New Jersey, USA) 353135 Syringe 1ml Becton Dickinson 301358 Trypsin Life Technologies (Waltham, Massachusetts, USA) Gentamycin Life Technologies 15710-049 Xilor Bio 98 s.r.l. (Milano, Italy) 2% Xylazin Zoletil Virbac (Carros, France) 359713301992 5% Zolazepam + 5% Tiletamine 24G Catheter Terumo (Rome, Italy) SR+DM2419PX HCl Carlo Erba Reagents (Milano, Italy) 403871 Liquid NaOH JT Baker (Center Valley, Pennsylvania, USA) 10095011 Powder Equipment Surgical Scalpel Albion Surgical Limited (Sheffield, England) Microtome Leica Microsystem ( Wetzlar, Germany) RM2235 Microscope Slides VWR International (Radnor, Pennsylvania, USA) 631-0108 Image Analyzer Zeiss (Jena, Germany) Cyres System