Avaliação da Eficácia da<em> H. pylori</em> Protein HP-NAP como uma ferramenta terapêutica para o tratamento de cancro da bexiga em um Modelo murino Orthotopic
Summary
Here the method to establish a syngeneic mouse model of orthotopic bladder tumour to evaluate the anti-tumour efficacy of the bacterial protein HP-NAP is described.
Abstract
Bladder cancer is one of the most common malignancies of the urogenital tract. Intravesical injection of Bacillus Calmette-Guérin (BCG) is the gold standard treatment for the high-grade non-muscle invasive bladder cancer (NMIBC). However, since the treatment-related side effects are relevant, newer biological response modifiers with a better benefit/side effects ratio are needed.
The tumour microenvironment can influence both tumour development and therapy efficacy. In order to obtain a good model, it is desirable to implant tumour cells in the organ from which the cancer originates.
In this protocol, we describe a method for establishing a tumour in the bladder cavity of female mice and subsequent delivery of therapeutic agents; the latter are exemplified by our use of Helicobacter pylori neutrophil activating protein (HP-NAP). A preliminary chemical burn of the mucosa, followed by the injection of mouse urothelial carcinoma cell line MB49 via urethral catheterization, enables the cells to attach to the bladder mucosa. After a period, required to allow an initial proliferation of the cells, mice are treated with HP-NAP, administrated again via catheterization. The anti-tumour activity of HP-NAP is evaluated comparing the tumour volume, the extent of necrosis and the degree of vascularization between vehicle- and HP-NAP-treated animals.
Introduction
O câncer de bexiga é um dos cânceres mais comuns do trato urogenital, com cerca de 75.000 novos casos por ano nos EUA 1. As altas taxas de recorrência ao longo da vida exigem acompanhamento, o que torna o câncer de bexiga um dos cancros mais caras para tratar. O tratamento padrão ouro para o alto grau NMIBC é a ressecção trans-uretral, seguida de imunoterapia intravesical com BCG. Embora o mecanismo exacto da actividade anti-tumoral de BCG continua a ser totalmente elucidado, admite-se que a activação de uma resposta imune mediada por células enriquecida em células T auxiliares (Th) e um T citotóxicas (Tc) um células é crucial para o sucesso da terapia de dois.
Apesar do fato que a BCG continua a ser o tratamento de escolha para NMIBC, uma elevada proporção de pacientes não responde à terapia; além disso, pode provocar um número de efeitos secundários: cerca de 70% dos tumores tratados recorrer após algum tempo e ~ 15% para a forma de progresso músculo-invasiva dadoença. Outros efeitos secundários associados com o tratamento com BCG incluem disúria, cistite e infecção renal 3-6.
O desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas deve levar em consideração a utilização de modelos pré-clínicos, seguindo in vitro de avaliação inicial; isto é particularmente relevante em tumores cuja microambiente pode influenciar significativamente o seu desenvolvimento e capacidade de resposta ao tratamento.
Ao longo da última década, têm abordado vários aspectos da actividade de modulação imunitária de HP-PNA, uma proteína produzida pela bactéria Helicobacter pylori, inicialmente identificados como capazes de promover a adesão endotelial de células polimorfonucleares (PMN) 7. Estruturalmente, HP-NAP pertence à proteína-protegendo o DNA sob condições de privação (DPS) da família 8 e é composto por 12 subunidades idênticas dispostas em um shell dodecameric.
Nós demonstramos que a HP-NAP éum receptor de tipo Toll (TLR) 2 agonista, com uma forte actividade de imuno-regulação responsáveis por dirigir a diferenciação de linfócitos T no sentido do fenótipo Th1, tanto in vitro como in vivo 9-10. Em virtude desta actividade, HP-NAP é capaz de redirecionar a resposta imune Th2 na resposta mais benéfico Th1 em um modelo murino de asma alérgica 11.
Para avaliar o potencial anti-tumoral Th1-dependente de HP-NAP, aproveitamos um mouse modelo de cancro da bexiga desenvolvido há vários anos por O'Donnel e colegas 12 para avaliar o impacto da vacina BCG.
Com este protocolo, demonstramos que a HP-NAP tem um potencial anti-tumoral forte contra o cancro da bexiga e que a eficácia da administração de HP-NAP é paralela à acumulação significativa, dentro de nós tumorais e linfonodos regionais, de ambos os linfócitos Th1 e Tc1 produtoras de Interferon ( IFN) -γ 13 </sup>. Os tumores isolados de camundongos tratados com HP-NAP mostrou mais de necrose e menor vascularização do que a contrapartida não tratada.
O presente relatório proporciona um protocolo stepbystep, detalhando a preparação dos animais e dos respectivos cateterismo uretral, a queima química necessária para a fixação de células à mucosa da bexiga, e a injecção das células tumorais. Nós também descrevem a administração tópica de HP-PNA que pode ser considerada como um protótipo de quaisquer agentes terapêuticos desenvolvidos para o tratamento de cancro da bexiga. A prova obtida através da comparação de tumores isolados de controle e-tratados com NAP HP animais enfatiza não só o fato de que a HP-NAP pode ser um bom candidato para imunoterapia do cancro de bexiga, mas também a eficácia geral da montagem experimental.
Protocol
Representative Results
Discussion
A maioria dos avanços na terapia do cancro requerem testes em modelos animais antes de começar testes clínicos. A possibilidade de estudar a biologia do tumor in vivo, aproveitando-se de modelos animais, representa uma ferramenta crucial para os pesquisadores que investigam patogênese do câncer, permitindo a avaliação de diferentes abordagens terapêuticas. Modelos ortotópicos sendo o padrão-ouro 14-15, tanto por causa da enorme quantidade de linhas celulares disponíveis para configurar um …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro, italiano Ministério da Universidade e da Pesquisa, projetos Prin e Progetti di Ricerca di Ateneo, conceder N ° CPDA137871, Fondazione Cariplo, conceder N ° 2011-0485 para MDB, e por Finanziamento Giovani studiosi, da Universidade de Pádua, para Gaia Codolo.
Materials
| Materials | |||
| C57BL/6J female mice | Harlan Italy (Udine, Italy) | ||
| MB49 Cells | Obtained from Prof. O'Donnel, University of Iowa Carver College of Medicine, Iowa, USA | ||
| RPMI | Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) | R8758 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D1408 | 10X, to be diluted in apyrogenic water |
| Flask | Becton Dickinson (Franklin Lakes, New Jersey, USA) | 353135 | |
| Syringe 1ml | Becton Dickinson | 301358 | |
| Trypsin | Life Technologies (Waltham, Massachusetts, USA) | ||
| Gentamycin | Life Technologies | 15710-049 | |
| Xilor | Bio 98 s.r.l. (Milano, Italy) | 2% Xylazin | |
| Zoletil | Virbac (Carros, France) | 359713301992 | 5% Zolazepam + 5% Tiletamine |
| 24G Catheter | Terumo (Rome, Italy) | SR+DM2419PX | |
| HCl | Carlo Erba Reagents (Milano, Italy) | 403871 | Liquid |
| NaOH | JT Baker (Center Valley, Pennsylvania, USA) | 10095011 | Powder |
| Equipment | |||
| Surgical Scalpel | Albion Surgical Limited (Sheffield, England) | ||
| Microtome | Leica Microsystem ( Wetzlar, Germany) | RM2235 | |
| Microscope Slides | VWR International (Radnor, Pennsylvania, USA) | 631-0108 | |
| Image Analyzer | Zeiss (Jena, Germany) | Cyres System |
Materials C57BL/6J female mice Harlan Italy (Udine, Italy) MB49 Cells Obtained from Prof. O'Donnel, University of Iowa Carver College of Medicine, Iowa, USA RPMI Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) R8758 FBS Sigma-Aldrich F7524 PBS Sigma-Aldrich D1408 10X, to be diluted in apyrogenic water Flask Becton Dickinson (Franklin Lakes, New Jersey, USA) 353135 Syringe 1ml Becton Dickinson 301358 Trypsin Life Technologies (Waltham, Massachusetts, USA) Gentamycin Life Technologies 15710-049 Xilor Bio 98 s.r.l. (Milano, Italy) 2% Xylazin Zoletil Virbac (Carros, France) 359713301992 5% Zolazepam + 5% Tiletamine 24G Catheter Terumo (Rome, Italy) SR+DM2419PX HCl Carlo Erba Reagents (Milano, Italy) 403871 Liquid NaOH JT Baker (Center Valley, Pennsylvania, USA) 10095011 Powder Equipment Surgical Scalpel Albion Surgical Limited (Sheffield, England) Microtome Leica Microsystem ( Wetzlar, Germany) RM2235 Microscope Slides VWR International (Radnor, Pennsylvania, USA) 631-0108 Image Analyzer Zeiss (Jena, Germany) Cyres System
Referências
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