Here the method to establish a syngeneic mouse model of orthotopic bladder tumour to evaluate the anti-tumour efficacy of the bacterial protein HP-NAP is described.
Bladder cancer is one of the most common malignancies of the urogenital tract. Intravesical injection of Bacillus Calmette-Guérin (BCG) is the gold standard treatment for the high-grade non-muscle invasive bladder cancer (NMIBC). However, since the treatment-related side effects are relevant, newer biological response modifiers with a better benefit/side effects ratio are needed.
The tumour microenvironment can influence both tumour development and therapy efficacy. In order to obtain a good model, it is desirable to implant tumour cells in the organ from which the cancer originates.
In this protocol, we describe a method for establishing a tumour in the bladder cavity of female mice and subsequent delivery of therapeutic agents; the latter are exemplified by our use of Helicobacter pylori neutrophil activating protein (HP-NAP). A preliminary chemical burn of the mucosa, followed by the injection of mouse urothelial carcinoma cell line MB49 via urethral catheterization, enables the cells to attach to the bladder mucosa. After a period, required to allow an initial proliferation of the cells, mice are treated with HP-NAP, administrated again via catheterization. The anti-tumour activity of HP-NAP is evaluated comparing the tumour volume, the extent of necrosis and the degree of vascularization between vehicle- and HP-NAP-treated animals.
Рак мочевого пузыря является одним из самых распространенных видов рака мочеполовой тракт, с почти 75000 новых случаев каждый год в США 1. Высокие темпы рецидива нуждаются в пожизненной последующей деятельности, что делает рак один из самых дорогостоящих видов рака для лечения мочевого пузыря. Золотым стандартом лечения для полноценного NMIBC транс уретры резекция с последующим внутрипузырной иммунотерапии БЦЖ. Хотя точный механизм противоопухолевой активности БЦЖ остается полностью выяснены, считается, что активация клеточного иммунного ответа, обогащенной Т-хелперов (Th) 1 и цитотоксических Т (Тс) 1 клетки имеет решающее значение для Успех терапии 2.
Несмотря на то, что БЦЖ остается препаратом выбора для NMIBC, высокая доля пациентов не реагируют на терапию; Кроме того, это может вызвать ряд побочных эффектов: около 70% пролеченных опухолей повторяются через какое-то время, и ~ 15% прогресса в мышечно-инвазивного видеБолезнь. Другие побочные эффекты, связанные с лечением БЦЖ включают дизурия, цистит и почечную инфекцию 3-6.
Разработка новых терапевтических стратегий необходимо принимать во внимание использование доклинических моделях, после первоначального пробирке оценки в; Это особенно актуально в опухолях которых микросреда может существенно повлиять на их развитие и реагирования на обращения.
За последнее десятилетие, мы обратились несколько аспектов иммунной модуляции деятельностью HP-NAP, белок, вырабатываемый бактерией Helicobacter Pylori, изначально определены как способные стимулировать эндотелия адгезию полиморфноядерных клеток (PMNs) 7. Конструктивно HP-NAP относится к ДНК-белок защиты при условиях голодали (DPS) семейства 8 и состоит из 12 идентичных субъединиц, расположенных в виде dodecameric оболочки.
Мы показали, что НР-НПДToll-подобный рецептор (TLR) 2 агонистом, с сильным иммуномодулирующее активностью, ответственной за рулем дифференцировку Т-лимфоцитов в сторону фенотипа Th1, как в пробирке и в естественных 9-10. В силу этого активности, HP-NAP способен перенаправить иммунный ответ Th2 в более выгодным ответ Th1 в мышиной модели аллергической астмы 11.
Чтобы оценить Th1-зависимого потенциал анти-опухоли HP-NAP, мы воспользовались мышиной модели рака мочевого пузыря, разработанной несколько лет назад О'Доннел и коллег 12 для оценки влияния администрации БЦЖ.
С этого протокола, мы показали, что НР-NAP имеет большой потенциал анти-опухолевого против рака мочевого пузыря, и что эффективность управления HP-NAP параллельно значительное накопление в пределах опухоли и регионарных лимфатических узлов, обоих Th1 и Tc1 лимфоцитов, продуцирующих интерферон ( ИФН) -γ 13 </SUP>. Опухоли, выделенные из HP-NAP-обработанных мышей показали более некроз и меньше васкуляризации, чем необработанные аналога.
Настоящий доклад обеспечивает протокол stepbystep, подробно подготовку животных, их уретры катетеризации, необходимого для прикрепления клеток к слизистой оболочки мочевого пузыря химический горение, и инъекции опухолевых клеток. Мы также описывают местное применение HP-NAP, что можно рассматривать как прототип любых терапевтических агентов, разработанных для лечения рака мочевого пузыря. Доказательства, полученные путем сравнения опухоли, выделенные из контроля и HP-NAP лечение животных подчеркивает не только тот факт, что HP-NAP может быть хорошим кандидатом для иммунотерапии рака мочевого пузыря, но и вообще эффективность экспериментальной установки.
Большинство достижений в лечении рака требуют испытания на животных моделях перед началом клинических испытаний. Возможность изучения биологии опухоли в естественных условиях, воспользовавшись животных моделях, представляет собой важнейшую инструмент для исследователей, изуч…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Associazione Italiana в Ла-суль-Ricerca Рак, итальянского министерства университетов и исследований, проектов и расходные к Progetti ди-ди-Ricerca Ateneo, грант № ° CPDA137871, Fondazione Cariplo, предоставить N ° 2011-0485 в MDB, и Finanziamento Джовани Studiosi Падуанского университета, в Gaia Codolo.
Materials | |||
C57BL/6J female mice | Harlan Italy (Udine, Italy) | ||
MB49 Cells | Obtained from Prof. O'Donnel, University of Iowa Carver College of Medicine, Iowa, USA | ||
RPMI | Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) | R8758 | |
FBS | Sigma-Aldrich | F7524 | |
PBS | Sigma-Aldrich | D1408 | 10X, to be diluted in apyrogenic water |
Flask | Becton Dickinson (Franklin Lakes, New Jersey, USA) | 353135 | |
Syringe 1ml | Becton Dickinson | 301358 | |
Trypsin | Life Technologies (Waltham, Massachusetts, USA) | ||
Gentamycin | Life Technologies | 15710-049 | |
Xilor | Bio 98 s.r.l. (Milano, Italy) | 2% Xylazin | |
Zoletil | Virbac (Carros, France) | 359713301992 | 5% Zolazepam + 5% Tiletamine |
24G Catheter | Terumo (Rome, Italy) | SR+DM2419PX | |
HCl | Carlo Erba Reagents (Milano, Italy) | 403871 | Liquid |
NaOH | JT Baker (Center Valley, Pennsylvania, USA) | 10095011 | Powder |
Equipment | |||
Surgical Scalpel | Albion Surgical Limited (Sheffield, England) | ||
Microtome | Leica Microsystem ( Wetzlar, Germany) | RM2235 | |
Microscope Slides | VWR International (Radnor, Pennsylvania, USA) | 631-0108 | |
Image Analyzer | Zeiss (Jena, Germany) | Cyres System |
Materials C57BL/6J female mice Harlan Italy (Udine, Italy) MB49 Cells Obtained from Prof. O'Donnel, University of Iowa Carver College of Medicine, Iowa, USA RPMI Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) R8758 FBS Sigma-Aldrich F7524 PBS Sigma-Aldrich D1408 10X, to be diluted in apyrogenic water Flask Becton Dickinson (Franklin Lakes, New Jersey, USA) 353135 Syringe 1ml Becton Dickinson 301358 Trypsin Life Technologies (Waltham, Massachusetts, USA) Gentamycin Life Technologies 15710-049 Xilor Bio 98 s.r.l. (Milano, Italy) 2% Xylazin Zoletil Virbac (Carros, France) 359713301992 5% Zolazepam + 5% Tiletamine 24G Catheter Terumo (Rome, Italy) SR+DM2419PX HCl Carlo Erba Reagents (Milano, Italy) 403871 Liquid NaOH JT Baker (Center Valley, Pennsylvania, USA) 10095011 Powder Equipment Surgical Scalpel Albion Surgical Limited (Sheffield, England) Microtome Leica Microsystem ( Wetzlar, Germany) RM2235 Microscope Slides VWR International (Radnor, Pennsylvania, USA) 631-0108 Image Analyzer Zeiss (Jena, Germany) Cyres System