Introduction
Blasenkrebs ist eine der häufigsten Krebserkrankungen des Urogenitaltrakts, mit fast 75.000 neue Fälle jedes Jahr in den USA 1. Hohe Rezidiv erfordern lebenslanges Follow-up, die Blasenkrebs eine der teuersten Krebsarten behandelbar machen. Der Goldstandard für die Behandlung hochgradigen NMIBC ist transurethralen Resektion, gefolgt von intravesikale Immuntherapie mit BCG. Obwohl der genaue Mechanismus der Antitumoraktivität von BCG, muss noch vollständig aufgeklärt werden, wird akzeptiert, dass die Aktivierung der zellvermittelten Immunantwort der T-Helfer (Th) 1 und zytotoxische T (Tc) 1-Zellen angereichert ist für Der Erfolg der Therapie 2.
Trotz der Tatsache, dass BCG bleibt die Behandlung der Wahl für NMIBC ein hoher Anteil der Patienten nicht auf die Therapie zu antworten; Darüber hinaus kann sie eine Reihe von Nebenwirkungen haben: ca. 70% der behandelten Tumore nach einer gewissen Zeit wieder auftreten und ~ 15% Fortschritt auf die muskelinvasiven Form desKrankheit. Andere Nebenwirkungen, die mit BCG-Behandlung verbunden sind Dysurie, Zystitis und Nierenentzündung 3-6.
Die Entwicklung neuer Therapiestrategien zu beachten die Verwendung von präklinischen Modellen zu nehmen, nach der ersten in-vitro-Bewertung; Dies ist besonders wichtig bei Tumoren, deren Mikromilieu deutlich ihre Entwicklung und Ansprechbarkeit auf die Behandlung beeinflussen.
Im Laufe des letzten Jahrzehnts haben verschiedene Aspekte der Immunmodulationsaktivität von HP-NAP, einer durch das Bakterium Helicobacter pylori hergestellte Protein gerichtet, zunächst als fördern kann endothelialen Adhäsion von polymorphkernigen Zellen (PMNs) 7 identifiziert. Strukturell gehört HP-NAP an die DNA-Schutz-Protein unter Bedingungen ausgehungert (DPS) Familie 8 und besteht aus 12 in einer dodecameren Schale angeordneten identischen Untereinheiten.
Wir haben gezeigt, dass HP-NAP isteinen Toll-like Rezeptor (TLR) 2-Agonisten mit einer starken immunmodulierende Aktivität zum Antreiben der Differenzierung von T-Lymphozyten verantwortlich Richtung des Th1-Phänotyp in vitro und in vivo 9-10. Im Rahmen dieser Tätigkeit ist HP-NAP in der Lage, die Th2-Immunantwort in die vorteil Th1-Antwort in einem Mausmodell von allergischem Asthma 11 umzuleiten.
Um die Th1-abhängige Anti-Tumor-Potenzial von HP-NAP bewerten, nutzten wir einem Mausmodell von Blasenkrebs durch O'Donnel und Kollegen 12 zur Bewertung der Auswirkungen der BCG Verwaltung vor einigen Jahren entwickelt.
Bei diesem Protokoll, zeigen wir, dass HP-NAP hat eine starke Antitumor-Potential gegen Blasenkrebs und dass die Wirksamkeit von HP-NAP Verabreichung Parallelen der signifikante Akkumulation im Tumor und regionale Lymphknoten, sowohl Th1- und Tc1 Lymphozyten produzieren Interferon ( IFN) -γ 13
Der vorliegende Bericht liefert eine stepbystep Protokoll Detaillierung der Vorbereitung der Tiere, deren Harnröhrenkatheter, der chemischen Verbrennung für die Befestigung der Zellen an die Blasenschleimhaut erforderlich ist und die Injektion der Tumorzellen. Wir beschreiben auch die topische Verabreichung von HP-NAP, die als Prototyp einer für die Behandlung von Blasenkrebs entwickelt therapeutische Wirkstoffe betrachtet werden kann. Die durch den Vergleich Tumoren von Steuerung und HP-NAP behandelten Tieren isoliert erlangten Beweismittel betont nicht nur die Tatsache, dass HP-NAP könnte ein guter Kandidat für Blasenkrebs Immuntherapie, sondern auch die allgemeine Wirksamkeit der Versuchsanordnung ist.
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Protocol
Alle Verfahren für die Behandlung der Tiere wurden von der italienischen Gesundheitsministerium (DM 204/2011-B) genehmigt worden.
1. Tiere
- Wachsen C57BL6 / J weiblichen Mäusen zu 8 Wochen in einzeln belüfteten Käfigen mit microisolation Filter.
Hinweis: Frauen werden bevorzugt, da die anatomische Anpassung ihrer äußeren urogenitalen Gerät macht die Katheterisierung einfacher als bei Männern.
2. Zellkultur
- Aufrechterhaltung der Maus Urothelkarzinom Zelllinie MB49 in RPMI 1640 Medium mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum und 50 ug / ml Gentamicin ergänzt bei 37 ° C in befeuchteter 5% CO 2.
- Wachsen MB49-Zellen in T-75-Flaschen zu 80% Konfluenz. Trypsinieren und resuspendieren in 0,5 x 10 5 bis 0,5 × 10 6 Zellen pro 150 & mgr; l PBS vor der Implantation in Mäuse.
3. Intravesikale Tumor Implant
- Betäuben Mäuse mit einer Mischung aus dem Narkose zoletil und xylor (33 mg / kg und 20 mg / kg) intraperitoneal injiziert.
- Zeigen Tiere in Rückenlage und fixieren die Hinterbeine in die Unterlage mit Tesafilm. Pfoten haben ausreichend getrennt, um die Harnröhrenmündung gut sichtbar und für die Einführung des Katheters zugänglich machen werden.
- Hinweis: Für die Katheterisierung, ist ein 24 G pädiatrischen Venenkatheter geeignet für 8 bis 10 Wochen alten Mäusen. Die Wahl des Katheters ist, um eine Leckage zwischen der Harnröhrenwand und dem Katheter Flüssigkeit zu vermeiden sehr wichtig. Größere Bohrung Katheter muss für größere oder älteren Mäusen verwendet werden.
- Mit einem kleinen Zange, kneifen eine Kante des äußeren Teil der Harnröhre und drehen Sie sie ganz sanft in Richtung der "Kopfende" der Mäuse. Diese Aktion macht die Harnröhrenmündung.
- Entfernen Sie den inneren Nadel des Katheters und legen Sie diese in die Harnröhre in einem Winkel von 45 °, leicht orientiertin Richtung der "Schwanzende" der Mäuse. Nicht mit Gewalt den Eingang des Katheters; im Falle von Widerstand, nur drehen Sie den Katheter sehr vorsichtig, bis es schlüpft in der Harnröhre. Wenn etwa 0,5-0,8 cm des Katheters in die Harnröhre, vorsichtig die Katheter parallel zum Schwanz der Mäuse und setzen Sie sie vollständig.
- Verwendung einer 1 ml Spritze, deren Nadel in den Katheter eingeführt werden muß, zu waschen, die Blase von Restharn durch Injizieren 200-300 ul sterilem PBS, und saugen die gesamte Flüssigkeit aus der Blase.
- Hinweis: Bei der Injektion von PBS, wird die Blase zu füllen und eine Schwellung zwischen den Hinterbeinen der Mäuse sichtbar sein; Dies bestätigt, dass die Katheter korrekt ist. Die meisten Katheter haben ein Totvolumen, die berücksichtigt werden müssen bei der Berechnung der Einspritzmenge.
- Verwendung einer sterilen 1-ml-Spritze, Injizieren 200 ul 0,1 N HCl. Füllen Sie die Blase, um seine ganze Wand zu verbrennen. Nach 10 sec, entfernen Sie alle Säure und sofort Neutralisaze durch Injizieren von 200 ul 0,1 N NaOH mit einer sterilen Spritze. Im Falle der Injektion von der höchsten Zahl der Zellen (0,5 × 10 6), wird die Ansäuerung Schritt nicht erforderlich.
- Saugen Sie all die Restflüssigkeit und spülen den Hohlraum mit 300 ul sterilem PBS.
- Leeren Sie die Blase durch Aspiration, und injizieren 150 ul PBS, das MB49-Zellen (Bereich von 0,5 x 10 5 bis 0,5 x 10 6) in die Blase. Lassen Sie die Spritze mit dem Katheter zusammengebaut, um das Austreten von Zellen zu vermeiden. Es ist besser, die Spritze durch Befestigung an der Unterlage mit Klebeband sichern.
- Nach 1 Stunde sanft zu extrahieren den Katheter aus der Harnröhre, und platzieren Sie die Maus in den Käfig, unter einer Glühlampe bis sie wach: dies geschieht in der Regel zwischen 1 und 2 Stunden nach dem Ende der Behandlung.
4. Intravesikale Lieferung von HP-NAP
- Anmerkung: mindestens 3 Tage nach der Zell Instillation, ist es möglich, den BeginnBehandlung.
- Catheterize wie in den Schritten 3.1 bis 3.4 beschrieben. Zu diesem Zeitpunkt ist es nicht notwendig, den Blasenwand mit HCl verbrennen.
- Unter Verwendung einer 1 ml Spritze, waschen Sie die Blase von Restharn durch Einspritzen von 200-300 ul sterilem PBS und saugen Sie die gesamte Flüssigkeit aus der Blase.
- Injizieren 50 ug HP-NAP pro 150 ul PBS in die Blase. Lassen Sie die Spritze an den Katheter angebracht ist, um eine Leckage von der Proteinlösung zu vermeiden. Befestigen Sie die Spritze durch Befestigung an der Unterlage mit Tesafilm.
- Nach 1 Stunde sanft zu extrahieren den Katheter aus der Harnröhre und platzieren Sie die Maus in den Käfig, unter einer Glühlampe, bis sie wach.
5. Tumor Explantate und histologische Analyse
- Am Ende der Behandlung, die Tiere zu opfern, legen Sie sie in Rückenlage und fixieren die Hinterbeine in die Unterlage mit Tesafilm.
- Mit Hilfe eines chirurgischen Skalpell einen vertikalen Schnitt etwa 1,52 cm lang durch die Haut und diePeritoneum, beginnend knapp über äußeren Genitalien auf die "Kopfende" der Mäuse. Um das Risiko einer Beschädigung der Blase zu minimieren, achten Sie besonders auf die Tiefe des Schnittes.
- Die Blase wird in der Mitte-Links des Schnitts positioniert werden und der Tumor sichtbar als dunkle rosa / violett Masse sein. Nach seiner Exzision, legen Sie die gesamte Blase in einem histologischen Käfig und befestigen Sie in 10% gepuffertem Formalin vor dem Einbetten in Paraffin.
- Zur histologischen und immunhistochemischen Analyse vorzubereiten Serienschnitte der Blase (46 & mgr; m Dicke) mit einem Standard-Mikrotoms.
- Färben die Schnitte mit Hämatoxylin / Eosin und fahren Sie mit der Berechnung der Tumorgröße (D xd 2) und Bestimmung des Prozentsatzes Nekrose pro Querschnittsfläche mit Hilfe eines computergestützten Bildanalysegerät.
- Für Behälter Zählen, gehen durch Färben der Abschnitte für die endotheliale Marker CD31 / PECAM, mit einem Standard-Immunperoxidase-Technik. Scannen Sie die Abschnitte at niedriger Leistung (4 x), um den Bereich der höchsten Gefäßdichte zu identifizieren. Innerhalb dieser Region zählen einzelnen Mikrogefäße in fünf separate Zufallsfelder mit hoher Leistung (20 x).
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Representative Results
Abbildung 1 zeigt die Kathetertechnik; die Maus katheterisiert und mit 0,5 x 10 6 MB49-Zellen eingeimpft. 3 Tage nach der Injektion von Tumorzellen wird eine Behandlung mit HP-NAP gestartet, um ihnen zu ermöglichen, an der Blasenwand zu befestigen und zu vermehren. Alle Tiere in der Kontrollgruppe gehörenden Entwicklung des Tumors; einige von ihnen vor dem Ende des 13-Tage-Zeitraum auf Grund der Verstopfung der Harnröhre sterben.
Nach der ersten Injektion mit HP-NAP, werden die Tiere behandelt alle drei Tage, für insgesamt vier Injektionen. Am Ende des Experiments, am Tag dreizehn, werden die Tiere getötet, und die Blasen zur histologischen und immunhistochemischen Analyse gesammelt. Wie in 2A gezeigt, ist das Volumen des Tumors in der Blase von HP-NAP-behandelten Mäusen wesentlich kleiner als der des Tumors mit Träger behandelten Mäusen (220 ± 62 mm 3 vs 830 ± 180 mm 3).
Interessant ist, während in mit Träger behandelten Tieren der Tumor dringt in das darunterliegende Fettgewebe, in 7 von 8 HP-NAP-behandelten Tieren der Tumor innerhalb der Blasenwand (2B) begrenzt. Schließlich wird Vaskularität reduziert und das Ausmaß der Nekrose in HP-NAP-behandelten Mäusen erhöht, bezogen auf Tiere (2B und C) zu steuern.
Abbildung 1. Mäuse Katheterisierung. Weibliche Mäuse sind betäubt und mit einem Katheter 24 G sterile Kanüle. Im rechten Bereich ist die Vergrößerung der black box. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Figur 2. Anti-Tumor-Aktivität von HP-NAP. Mäuse am Tag 0 mit MB49-Zellen (0,5 × 10 6) implantiert wird, werden mit 50 ug HP-NAP oder PBS (Vehikel) an den Tagen 3, 6, 9 und Verarbeitung 12. Alle Tiere werden am Tag 13 (A) Repräsentative histologische Analyse auf Blasen von Kontrollmäusen und HP-NAP-behandelten Tieren, und das Tumorvolumen Quantifizierung getrennt getötet. (B) Vergrößerung der Abschnitte der Platte A und Prozentsatz der Nekrose in den beiden Gruppen von Tieren. (C) reseziert Blasen, für CD31 / PECAM gefärbt; repräsentativen Schnitten aus Kontrolle und HP-NAP behandelten Tieren dargestellt. Die Quantifizierung der Gefäßdichte (C, rechts); HPF, Hochleistungs-Feldern. Daten stellen den Mittelwert ± SD; n = 8 Mäuse pro Gruppe. Die statistische Signifikanz wurde durch den Student-t -Test (** p <0.01) bestimmt. Figur aus Codolo et geändertal. 13. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Der Großteil der Fortschritte in der Krebstherapie erfordern Tests in Tiermodellen, bevor klinische Studien. Die Möglichkeit, das Studium der Tumorbiologie in vivo, unter Ausnutzung der Tier-Modelle, ist ein entscheidender Werkzeug für Forscher untersuchen Krebs Pathogenese, so dass die Bewertung der unterschiedlichen Therapieansätze. Orthotopen Modellen bleibt der Goldstandard 14-15, sowohl wegen der riesigen Menge an Zelllinien, die Einrichtung eines Tumor-Modell, und weil sie die Umgebung des natürlich vorkommenden Tumor 16 zu imitieren.
Außerdem Einrichtung orthotopen Modellen von Krebs in syngenen Mäusen, wie hier beschrieben, ist besonders relevant im Fall von Studien auf die Untersuchung neuer therapeutischer Strategien basierend auf Immuntherapie gerichtet, da letztere in immundefizienten Mäusen, die xenoimplants unterziehen nicht möglich.
Die in diesem Protokoll dargestellten Methodik beschreibt ter Katheterisierung der weiblichen Harnröhre Maus, die sowohl die Inokulation von Tumorzellen und die Verabreichung von therapeutischen Mitteln in den Harnblasenraum ermöglicht.
Der Vorteil der Vorkonditionierung des Blasenwand durch ein säure Burn (wie oben beschrieben, anstelle von anderen Ansätzen, wie beispielsweise die Verwendung von Trypsin oder Poly-Lysin), das heißt die Förderung der Entwicklung von großen und stark invasive Tumoren. Im Gegenteil, der Vorkonditionierung mit Trypsin und poly-Lysin, ergibt kleinere und weniger invasiven Tumoren, wahrscheinlich aufgrund einer nachteiligen Wirkung der Rückstände dieser Stoffe auf die Lebensfähigkeit der Tumorzellen 17. Die Säure-Burn wird auch zu einer anderen Vorbehandlung-System basierend auf elektrische Kauterisation bevorzugt, weil so kann die Perforation der Blasenwand und die Verbreitung des Tumors in das Peritoneum 18 verursachen.
Das Protokoll wurde für die Kurzzeitstudien (~ 13 Tage) optimiert. Implantieren des proper Anzahl von Zellen ist kritisch, da eine höhere Anzahl von Zellen wird zu einer schnelleren Tumorwachstum und möglicherweise Verlust von Tieren wegen großer Tumorbelastung führen. Außerdem, bis der Benutzer sicher mit der Technik wird, gibt es ein gewisses Risiko einer Beschädigung der Harnröhre oder Harnblase, wodurch der Tod der Tiere. Nach unserer Erfahrung ist jedoch, wenn die Tiere angemessen betrieben werden (und somit nicht während des Verfahrens zu sterben), sie leben ohne dass für die Dauer der Experimente (13 Tage). Darüber hinaus kann durch Verringern der Anzahl von Zellen injiziert, ist es möglich, die Dauer der Experimente zu verlängern.
Wir haben dieses Modell, um die Anti-Tumor-Aktivität des Proteins HP-NAP durch Helicobacter pylori produziert zu bewerten, mit dem Ziel, sich zu verbessern, und schließlich zu ersetzen, die aktuelle Therapie auf BCG durch eine neue mit einem höheren Leistungen / Nebenwirkungen ausgestattet Verhältnis. Allgemeiner kann diese experimentellen Ansatz in allen vorge clini erlassencal Auswertungen, die die Abgabe von therapeutischen Mitteln in den Harnblasenraum erforderlich.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro, italienische Ministerium für Universität und Forschung, Projekte und Prin Progetti di Ricerca di Ateneo, gewähren N ° CPDA137871, Fondazione Cariplo unterstützt wird, gewähren N ° 2011-0485 zu MdB, und durch Finanziamento Giovani Studiosi, Universität Padua, um Gaia Codolo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| C57BL/6J female mice | Harlan Italy (Udine, Italy) | ||
| MB49 Cells | Obtained from Prof. O'Donnel, University of Iowa Carver College of Medicine, Iowa, USA | ||
| RPMI | Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) | R8758 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D1408 | 10X, to be diluted in apyrogenic water |
| Flask | Becton Dickinson (Franklin Lakes, New Jersey, USA) | 353135 | |
| Syringe 1ml | Becton Dickinson | 301358 | |
| Trypsin | Life Technologies (Waltham, Massachusetts, USA) | ||
| Gentamycin | Life Technologies | 15710-049 | |
| Xilor | Bio 98 s.r.l. (Milano, Italy) | 2% Xylazin | |
| Zoletil | Virbac (Carros, France) | 359713301992 | 5% Zolazepam + 5% Tiletamine |
| 24G Catheter | Terumo (Rome, Italy) | SR+DM2419PX | |
| HCl | Carlo Erba Reagents (Milano, Italy) | 403871 | Liquid |
| NaOH | JT Baker (Center Valley, Pennsylvania, USA) | 10095011 | Powder |
| Equipment | |||
| Surgical Scalpel | Albion Surgical Limited (Sheffield, England) | ||
| Microtome | Leica Microsystem ( Wetzlar, Germany) | RM2235 | |
| Microscope Slides | VWR International (Radnor, Pennsylvania, USA) | 631-0108 | |
| Image Analyzer | Zeiss (Jena, Germany) | Cyres System | |
References
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