Introduction
Mesane kanseri ABD'de 1 yaklaşık 75.000 yeni vaka her yıl, ürogenital sistem en yaygın kanserlerden biridir. Nüks oranlarının yüksek mesane kanseri tedavisinde costliest kanserlerin biri yapar ömür boyu takip gerektirir. yüksek dereceli NMIBC için altın standart tedavi BCG intravezikal immünoterapi ardından, trans-üretral rezeksiyon olduğunu. BCG, anti-tümör aktivitesi kesin mekanizması tam olarak aydınlatılamamıştır olmasına rağmen, bu T yardımcı (Th) 1 ve sitotoksik T (Tc), 1 hücreleri, zenginleştirilmiş bir hücre-aracılı bağışıklık karşılığının harekete geçirmek için çok önemli olduğu kabul edilmektedir tedavinin 2. başarısı.
BCG NMIBC için seçilecek tedavi olmaya devam olmasına rağmen, tedaviye yanıt vermeyen hastalarda yüksek oranda; Ayrıca, yan etkilerin bir neden olabilir: tedavi edilen tümörlerin yaklaşık% 70 kas-invaziv forma ~% 15 ilerleme bir süre sonra nüksetme vehastalığı. BCG tedavisi ile ilişkili diğer yan etkiler dizüri, sistit ve böbrek enfeksiyonu 3-6 arasındadır.
yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesi, ilk in vitro değerlendirmenin ardından, dikkate klinik öncesi modellerinin kullanımını almalıdır; Bu kimin mikroçevresinin ölçüde tedaviye gelişimlerini ve yanıt etkileyebilecek tümörlerde özellikle önemlidir.
Son on yılda, biz, HP-NAP, bakteri Helicobacter pylori tarafından üretilen bir proteinin bağışıklık modüle aktivitesinin birden yönlerini ele alınmıştır, başlangıçta polimorfonükleer hücreler (PMN) 7 endotel yapışmasını teşvik yeteneğine olarak belirledi. Yapısal olarak, HP-NAP hasret koşulları (DPS) ailesi 8 altında DNA koruyucu protein aittir ve bir dodecameric kabuk düzenlenmiş 12 özdeş alt birimden oluşmaktadır.
Biz, HP-NAP olduğunu göstermiştirT farklılaşmasını tahrik sorumlu güçlü bir immüno-modüle edici aktivitesi olan bir Toll benzeri reseptör (TLR) 2 agonisti, in vitro ve in vivo 9-10 hem de TH1 fenotipine doğru lenfosit. Bu aktivite sayesinde HP, NAP-alerjik astım 11 bir murin modelinde daha faydalı Th1 yanıt olarak Th2 immun cevabı yönlendirmek edebilmektedir.
HP-NAP Th1 bağımlı anti-tümör potansiyelini değerlendirmek için, BCG yönetiminin etkisini değerlendirmek için O'Donnel ve arkadaşları 12 tarafından birkaç yıl önce geliştirilen mesane kanseri bir fare modelinde yararlandı.
Bu protokol ile, HP-NAP mesane kanserine karşı güçlü bir anti-tümör potansiyele sahip olduğunu ve HP-NAP yönetiminin etkinliği (interferon üreten hem Th1 ve Tc1 lenfositlerin, tümör ve bölgesel lenf düğümleri içinde önemli birikimi ile paralellik göstermektedir IFN) 13 -γ
Bu rapor, hayvanların hazırlanması, bunların üretral kateter, mesane mukozasının hücrelerin bağlanması için gerekli olan kimyasal yanma ve tümör hücrelerinin enjeksiyonu ayrıntılı bir adımadım protokolü sağlar. Ayrıca mesane kanseri tedavisi için geliştirilmiş herhangi bir terapötik maddelerin bir prototip olarak kabul edilebilir, HP-NAP lokal olarak uygulanmasını tarif eder. Kontrol ve HP-NAP-tedavi edilen hayvanlardan izole edilen tümör karşılaştırarak elde edilen deliller, sadece HP NAP mesane kanseri immünoterapi için iyi bir aday değil, aynı zamanda kurmak deneysel genel etkinliği olabileceği gerçeğini vurgulamaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan taşıma için tüm işlemler İtalyan Sağlık Bakanlığı (DM 204/2011-B) tarafından onaylanmıştır.
1. Hayvanlar
- Microisolation filtreleri ile ayrı ayrı havalandırmalı kafeslerde yaşı 8 hafta C57BL6 / J dişi fareler büyütün.
Not: Onların dış ürogenital aygıtının anatomik konformasyon erkeklerde daha kateterizasyon kolay işler çünkü dişiler tercih edilir.
2. Hücre Kültürü
- Nemlendirilmiş bir% 5 CO2 içinde 37 ° C'de,% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu ve 50 ug / ml gentamisin ile takviye edilmiş RPMI 1640 ortamı içinde, fare ürotelyal karsinoma hücre hattı MB49 koruyun.
- % 80 izdiham T-75 şişelerinde MB49 hücreleri büyütün. Trypsinize ve 0.5 × 10 5 de tekrar süspansiyon - farelerde implantasyon öncesi PBS 150 ul başına 0,5 x 10 6 hücre.
3. İntravezikal Tümör İmplant
- (Sırasıyla, 33 mg / kg ve 20 mg / kg), anestetikler zoletil ve xylor bir karışımını kullanarak fareler anestezi, karın içinden enjekte edilmiştir.
- Bir yatar pozisyonda hayvanlar koyun ve kapaklar ile ped arka ayakları düzeltmek. Pençeler yeterince iyi görülebilir ve kateterin yerleştirilmesi için kolaylıkla erişilebilir üretral meatusun işlemek için ayrılması var.
- Not: kateterizasyon, bir 24 G kateter çocuk 8-10 haftalık fareler için uygundur. Kateterin bir seçim üretral duvar ve kateter arasındaki sıvı sızmasını önlemek için çok önemlidir. Büyük kalibreli kateterler daha büyük veya daha büyük fareler için kullanılmalıdır.
- Küçük bir cımbız kullanarak, üretranın dış kısmının bir kenarı çimdik ve farelerin "baş ucuna" doğru çok hafifçe bükün. Bu eylem üretral meatus ortaya çıkarır.
- 45 ° 'lik bir açı ile üretra ikinci kateterin iç iğne çıkarın ve ekleme, hafif yönlendirilmişFarelerin "kuyruk sonunda" doğru. Kateterin giriş zorlamayın; Bu üretranın içine fişleri kadar direnç durumunda, sadece, çok yavaşça kateter bükün. Kateterin yaklaşık 0.5-0.8 cm idrar olduğunda, dikkatli bir şekilde farelerin kuyruk kateter paralel yer tamamen yerleştirin.
- Kateter takılı olması gereken bir iğne olan bir 1 ml şırınga kullanarak, steril PBS 200-300 ul enjekte edilerek kalan idrar mesane yıkama ve mesane tüm sıvı aspire.
- Not: PBS enjekte ederken, mesane dolduracaktır ve bir şişme farelerin arka bacaklarının arasına görünür olacaktır; Bu kateterizasyon doğru olduğunu teyit etmektedir. Çoğu kateterler enjeksiyon hacmi hesaplanmasında dikkate alınması gereken bir ölü hacme sahip.
- 1 ml steril bir şırınga kullanılarak, 0.1 N HCI, 200 ul enjekte edilir. Onun tüm duvar yakmak için mesaneyi doldurun. 10 saniye sonra, her asidi çıkarmak hemen neutralisteril bir şırınga ile 0.1 N NaOH, 200 ul enjekte edilerek ze. En yüksek hücre sayısı (0.5 x 10 6) enjeksiyonu durumunda, asitleme aşaması gerekli değildir.
- Aspire tüm artık sıvı hemen steril PBS içinde 300 ul boşluğu yıkayın.
- Mesane içine - (0.5 x 10 6 aralık 0.5 × 10 5) aspirasyonu ile mesaneyi boşaltın ve MB49 hücreleri içeren PBS 150 ul enjekte edilir. Hücrelerin sızmasını önlemek için kateter monte şırınga bırakın. Bu kapaklar ile pad sabitlemek şırıngayı sabitlemek için iyidir.
- 1 saat sonra, yavaşça üretradan kateter ayıklamak ve onlar uyanık kadar bir akkor lambası altında, kafes içinde fareler yerleştirin: bu genellikle tedavinin bitiminden 1 ila 2 saat oluşur.
HP-NAP 4. ntravezikal Teslimat
- Not: Hücre uygulamasından sonra en az 3 gün, bu başlamak mümkündürTedavi.
- Adımlar 3,1-3,4 açıklandığı gibi kateterize. Bu aşamada, bu HCI ile mesane duvarı yakmak için gerekli değildir.
- 1 ml şırınga kullanarak, steril PBS 200-300 ul enjekte edilerek kalan idrar mesane yıkama ve mesane tüm sıvı aspire.
- Mesane içine 150 ul PBS başına HP NAP 50 ug enjekte edilir. Protein çözeltisi akıntısını önlemek için kateter takılı şırınga bırakın. Kapaklar ile pad sabitlemek şırıngayı sabitleyin.
- Onlar uyanık kadar bir akkor lambası altında, 1 saat sonra, yavaşça üretradan kateter ayıklamak ve kafese fareler yerleştirin.
5. Tümör Eksplantlarındaki ve Histolojik Analiz
- Tedavi sonunda, hayvanlar kurban yatar pozisyonda yerleştirin ve kapaklar ile ped arka ayakları düzeltmek.
- Cerrahi neşter kullanılarak, cilt ve içinden yaklaşık 1.52 cm uzunluğunda dikey bir kesi yapmakPeriton, sadece fareler "baş ucuna" dış genital üzerinde başlayan. Mesane zarar riskini en aza indirmek için, kesme derinliği özellikle dikkat.
- Mesane kesim merkez sol yerleştirilmiş olacak ve tümör koyu pembe / mor kitle olarak görülebilir. Kesildikten sonra, histolojik kafese Bütün mesane yerleştirin ve parafin içine yerleştirilmeden önce,% 10 tamponlu formalin içinde sabitlenir.
- Histolojik ve immün histokimyasal analizi için, standart bir mikrotom kullanılarak mesane (46 um kalınlığında) seri kesitler hazırlamak.
- Hematoksilin / eozin ile bölümleri Leke ve tümör büyüklüğü (D xd 2) ve bir bilgisayar destekli görüntü analiz cihazı kullanarak enine kesit alanı başına nekroz oranını belirlemek hesaplama ile devam eder.
- Damar sayımı, standart bir immünoperoksidaz tekniği kullanılarak, endotelyal işaretleyici CD31 / PECAM için bölümleri boyama ile devam edin. Bölümleri tara BirEn yüksek vasküler yoğunluğu bölgeyi tanımlamak için düşük güç (4 ×) t. Bu Bölgede, yüksek güç (20 ×) beş ayrı rastgele alanlarda bireysel mikrodamarlar saymak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1, kateterizasyon tekniği göstermektedir; Fare kateterize ve 0.5 × 10 6 MB49 hücreleri ile damlatılır. HP-NAP ile tedavi mesane duvarına yapışır ve çoğalırlar sağlayacak, 3 gün, tümör hücrelerinin enjeksiyonundan sonra başlatılır. Kontrol grubuna ait bütün hayvanlar tümör geliştirme; bunların bazıları üretra tıkanıklığı 13 günlük sürenin bitiminden önce ölebilir.
HP-NAP ile ilk enjeksiyondan sonra, hayvanlar dört enjeksiyon toplam, her üç günde bir tedavi edilir. Deneyin sonunda, günde on üç, hayvanlar kurban edilmiş ve histolojik mesaneler ve bağışıklık histokimyasal analiz için toplanmıştır. Şekil 2A'da gösterildiği gibi, HP-NAP-muamele edilmiş farelerden alınan mesane içinde tümör hacmi 830 ± 1 v (220 ± 62 mm3, araç ile tedavi edilmiş farelerin tümör önemli ölçüde daha küçüktür80 mm3).
İlginç şekilde, araçla tedavi edilen hayvanlarda tümör tümörlü mesane duvarı (Şekil 2B) içinde sınırlı 8'in HP NAP-ile tedavi edilen hayvanların 7'sinde, Altındaki yağ dokusu da yayılmıştır. Son olarak, vaskülarite azalır ve nekroz ölçüde hayvanlar (Şekil 2B ve C) kontrole göre HP NAP-ile tedavi edilmiş farelerde artar.
Şekil 1. Fare kateterizasyon. Dişi fareler anestezi ve 24 G steril kanül kullanılarak kateterize. Sağ panelde siyah kutu büyütme olduğunu. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
HP UEP Şekil 2. Anti-tümör aktivitesi. Fareler, MB49 hücreleri (0.5 x 10 6) ile 0 implante, 3, 6, 9 ve 50, HP-NAP veya PBS (araç) ug ile muamele edilir 12. Tüm hayvanlar 13. günde (A) kontrol farelerinde ve HP-NAP ile tedavi edilen hayvanlar, ve tümör hacmi ölçümü izole mesanelerde Örnek histolojik analiz ile öldürüldü. Iki grup hayvandan panel A ve nekroz yüzdesi bölümlerinin (B) Büyütme. (C) CD31 / PECAM için lekeli Çıkarılan mesane; Kontrol ve HP-NAP-muamele edilmiş hayvanlardan elde edilen temsili bölümleri gösterilmektedir. Mikrodamar yoğunluğu (C sağ panel) Kantitasyonu; HPF, highpower alanlar. Veriler ortalama ± SD temsil eder; Grup başına n = 8 fare. Istatistiksel farkları, Öğrenci t-testi (** p <0.01) ile tespit edilmiştir. Codolo et değiştirilmiş Şekilark. 13. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
kanser tedavisinde ilerlemelere çoğunluğu klinik denemeler başlamadan önce hayvan modellerinde test gerektirir. in vivo tümör biyolojisi okuyan hayvan modellerinde yararlanarak olasılığı, farklı tedavi yaklaşımları değerlendirmesini sağlayan kanser patogenezinde araştıran araştırmacılar için önemli bir araç temsil eder. Ortotopik modeller altın standart 14-15 kalır, hem de çünkü tümör modeli kurmak ve mevcut hücre hatlarının büyük miktarda doğal olarak oluşan tümör 16 ortamı taklit çünkü.
Burada açıklandığı gibi ikinci xenoimplants tabi bağışıklık eksikliği olan farelerde mümkün değildir çünkü Dahası, sinjenik farelerde kanser ortotopik modellerini kurma, immünoterapi dayalı yeni tedavi stratejilerinin araştırılması amacıyla çalışmaların durumunda özellikle önemlidir.
Bu protokolde gösterilen metodoloji t açıklartümör hücrelerinin aşılanmasını ve mesane boşluğuna terapötik maddelerin uygulanmasını hem izin veren bir dişi fare üretranın O kateterizasyon.
(yerine örneğin tripsin ya da poli-lisin kullanımı gibi diğer yaklaşımlar, ve, yukarıda tarif edilenler gibi) bir asit yanığı ile mesane duvarı ön muameleden geçirilmesi avantajı, büyük ve oldukça invaziv tümörlerin gelişimini teşvik olmasıdır. Muhtemelen, tümör hücrelerinin 17 canlılığı üzerindeki bu maddelerin kalıntılarının bir zararlı etki için tripsin ve poli-lizin, daha küçük ve daha az invaziv tümörlerde sonuçları ile ön koşullandırma tersine,. İkinci mesane duvarının delinmesi ve periton 18 içine tümörün yayılmasını neden olabilir, çünkü asit yanığı da elektrik koterizasyon dayalı başka önkoşullanma sistemine tercih edilir.
protokol kısa süreli çalışmalarda (~ 13 gün) için optimize edilmiştir. Pr implantedaha yüksek bir hücre sayısı nedeniyle geniş bir tümör daha hızlı tümör büyümesi ve muhtemelen hayvanların kaybına neden olur çünkü hücrelerin oper sayısı kritik önem taşır. Kullanıcı tekniği ile emin olana kadar Dahası, böylece hayvanların ölümüne neden üretra veya mesane zarar riskin belli bir derecesi vardır. Hayvanlar yeterli (işlem sırasında ölme ve böylece) işletilen eğer bizim deneyim, ancak onlar deneylerde (13 gün) süresince acı olmadan yaşamak. Ayrıca, enjekte edilen hücrelerin sayısını azaltarak, bu deney süresini uzatmak mümkündür.
Biz, daha yüksek bir fayda / yan etkilere sahiptir yenisi ile BCG göre mevcut tedaviyi geliştirmek ve en sonunda yerine amacıyla, Helicobacter pylori tarafından üretilen protein, HP-NAP anti-tümör etkisinin değerlendirilmesi için, bu model kullanılan oranı. Daha genel olarak, bu deneysel yaklaşım tüm ön Clini kabul edilebilirMesane boşluğuna terapötik ajanların teslimini gerektiren cal değerlendirmeler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını olduğunu beyan ederim.
Acknowledgments
Bu eser Associazione Italiana per la Ricerca sul Yengeç, Üniversite İtalyan Bakanlığı ve Araştırma İlkeleri projeleri ve Progetti di Ricerca di Ateneo, hibe N ° CPDA137871, Fondazione Cariplo tarafından desteklenen N MdB için 2011-0485 ° ve Finanziamento Giovani tarafından hibe Gaia Codolo için Studiosi, Padua Üniversitesi,.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| C57BL/6J female mice | Harlan Italy (Udine, Italy) | ||
| MB49 Cells | Obtained from Prof. O'Donnel, University of Iowa Carver College of Medicine, Iowa, USA | ||
| RPMI | Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) | R8758 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D1408 | 10X, to be diluted in apyrogenic water |
| Flask | Becton Dickinson (Franklin Lakes, New Jersey, USA) | 353135 | |
| Syringe 1ml | Becton Dickinson | 301358 | |
| Trypsin | Life Technologies (Waltham, Massachusetts, USA) | ||
| Gentamycin | Life Technologies | 15710-049 | |
| Xilor | Bio 98 s.r.l. (Milano, Italy) | 2% Xylazin | |
| Zoletil | Virbac (Carros, France) | 359713301992 | 5% Zolazepam + 5% Tiletamine |
| 24G Catheter | Terumo (Rome, Italy) | SR+DM2419PX | |
| HCl | Carlo Erba Reagents (Milano, Italy) | 403871 | Liquid |
| NaOH | JT Baker (Center Valley, Pennsylvania, USA) | 10095011 | Powder |
| Equipment | |||
| Surgical Scalpel | Albion Surgical Limited (Sheffield, England) | ||
| Microtome | Leica Microsystem ( Wetzlar, Germany) | RM2235 | |
| Microscope Slides | VWR International (Radnor, Pennsylvania, USA) | 631-0108 | |
| Image Analyzer | Zeiss (Jena, Germany) | Cyres System | |
References
- Siegel, R., Ma, J., Zou, Z., Cancerstatistics Jemal, A. CA Cancer J Clin. 64, 9-29 (2014).
- Saint, F., et al. Prognostic value of a T helper 1 urinary cytokine response after intravesical bacillus Calmette-Guerin treatment for superficial bladder cancer. J Urol. 167, 364-367 (2002).
- Shahin, O., Thalmann, G. N., Rentsch, C., Mazzucchelli, L., Studer, U. E. A retrospective analysis of 153 patients treated with or without intravesical bacillus Calmette-Guerin for primary stage T1 grade 3 bladder cancer: recurrence, progression and survival. J Urol. 169, 96-100 (2003).
- Lamm, D. L.
- De Jager, R., et al. Long-term complete remission in bladder carcinoma in situ with intravesical TICE bacillus Calmette Guerin. Overview analysis of six phase II clinical trials. Urology. 38, 507-513 (1991).
- Dovedi, S. J., Davies, B. R. Emerging targeted therapies for bladder cancer: a disease waiting for a drug. Cancer Metastasis Rev. 28, 355-367 (2009).
- Evans, D. J., et al. Characterization of a Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. Infect Immun. 63, 2213-2220 (1995).
- Grant, R. A., Filman, D. J., Finkel, S. E., Kolter, R., Hogle, J. M. The crystal structure of Dps, a ferritin homolog that binds and protects DNA. Nat Struct Biol. 5, 294-303 (1998).
- Amedei, A., et al. The neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori promotes Th1 immune responses. J Clin Invest. 116, 1092-1101 (2006).
- Bernard, M., D'Elios, M. M. The immune modulating activity of the Helicobacter pylori HP-NAP: Friend or foe. Toxicon. 56, 1186-1192 (2010).
- Codolo, G., et al. The neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori down-modulates Th2 inflammation in ovalbumin-induced allergic asthma. Cell Microbiol. 10, 2355-2363 (2008).
- Gunther, J. H., et al. Optimizing syngeneic orthotopic murine bladder cancer (MB49). Cancer Res. 59, 2834-2837 (1999).
- Codolo, G., et al. HP-NAP inhibits the growth of bladder cancer in mice by activating a cytotoxic Th1 response. Cancer Immunol Immunother. 61, 31-40 (2012).
- Chan, E., Patel, A., Heston, W., Larchian, W. Mouse orthotopic models for bladder cancer research. BJU Int. 104, 1286-1291 (2009).
- Kubota, T. Metastatic models of human cancer xenografted in the nude mouse: the importance of orthotopic transplantation. J Cell Biochem. 56, 4-8 (1994).
- Loi, M., et al. The use of the orthotopic model to validate antivascular therapies for cancer. Int J Dev Biol. 55, 547-555 (2011).
- Miyazaki, K., et al. Preconditioning methods influence tumor property in an orthotopic bladder urothelial carcinoma rat model. Mol Clin Oncol. 2, 65-70 (2014).
- Horiguchi, Y., et al. Establishment of orthotopic mouse superficial bladder tumor model for studies on intravesical treatments. Hum Cell. 21, 57-63 (2008).
