الهندسة 3D Cellularized الهلام الكولاجين لتجديد الأنسجة الوعائية
Summary
In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.
Abstract
ومن المعروف أن المواد الاصطناعية لبدء المضاعفات السريرية مثل التهاب، تضيق، والتهابات عندما زرعت كبدائل الأوعية الدموية. وقد الكولاجين تستخدم على نطاق واسع لمجموعة واسعة من التطبيقات الطبية الحيوية، ويعتبر بديلا صالحا للمواد الاصطناعية نظرا لتوافق مع الحياة الأصيل (أي استضداد منخفضة، والالتهابات، والاستجابات السامة للخلايا). ومع ذلك، فإن الخواص الميكانيكية المحدودة والمتعلقة منخفضة اليد قدرة المواد الهلامية الكولاجين أعاقت استخدامها كمواد سقالة لهندسة الأنسجة الوعائية. وبالتالي، فإن الأساس المنطقي وراء هذا العمل الأول لهندسة المواد الهلامية الكولاجين cellularized إلى الهندسة على شكل أنبوبي والثانية لتعزيز خلايا العضلات الملساء إعادة تنظيم مدفوعة الكولاجين مصفوفة للحصول على أنسجة صلبة بما فيه الكفاية ليتم التعامل معها.
وتستند الاستراتيجية الموصوفة هنا على تجميع مباشرة من الكولاجين وخلايا العضلات الملساء (بناء) في cyli 3Dالهندسة ndrical مع استخدام تقنية الصب. تتطلب هذه العملية فترة النضج، وخلالها يبني يتم تربيتها في مفاعل حيوي في ظل ظروف ثابتة (بدون قيود الميكانيكية الحيوية الخارجية التطبيقية) لمدة 1 أو 2 أسابيع. في "مفاعل حيوي ثابت" يوفر بيئة معقمة المراقبة والتحكم (درجة الحموضة، ودرجة الحرارة، وتبادل الغازات، توريد المواد الغذائية والتخلص من النفايات) إلى بنيات. خلال الفترة الثقافة، أجريت قياسات سمك لتقييم إعادة مدفوعة خلايا المصفوفة الكولاجين، وتم قياس استهلاك الجلوكوز ومعدلات إنتاج اللاكتات لرصد الخلايا النشاط الأيضي. وأخيرا، تم تقييم الخواص الميكانيكية واللزجة ليبني أنبوبي الناتجة عن ذلك. تحقيقا لهذه الغاية، بروتوكولات محددة ومركزة الدراية (التلاعب، تجتاح، والعمل في بيئة المائية، وهلم جرا) وضعت لتوصيف الأنسجة هندسيا.
Introduction
هندسة الأنسجة الوعائية تتصور الاستراتيجيات المختلفة التي تهدف إلى تصنيع السفن هندسيا، بما في ذلك الطعوم بناء على السقالات الاصطناعية، والأوعية الدموية الأنسجة المهندسة أساس ورقة خلايا (TEBVs)، والمصفوفة خارج الخلية (ECM) على مكونات TEBVs. من بين هذه المناهج، والبوليمرات الاصطناعية يحمل خصائص ميكانيكية جيدة، ولكنها تشترك في العيب المشترك لأنها تفتقر إلى النشاط الحيوي 1. طريقة أساس ورقة خلايا يسمح للإنتاج بدائل الأوعية الدموية هندسيا مع خصائص ميكانيكية عالية، ولكن الوقت اللازم لإنتاج مثل هذه الطعوم هو ما يقرب من 28 أسابيع 2. البوليمرات الحيوية الطبيعية للECM، مثل الكولاجين، والإيلاستين، الفيبرين 3 أو مزيج منها، تبقى المواد المعيار الذهبي لالسقالات هندسة الأنسجة. هذا هو في المقام الأول وذلك لسبب أن هذه المواد تمتلك توافق مع الحياة جيدة عموما في حين التمكن من إحداث الاستجابات الخلوية وظيفية 4-5. ومن بين هذه البوليمر الحيويالصورة، النوع الأول الكولاجين هو واحد من البروتين الحاملة الأكثر وفرة والسائد من ECM في العديد من الأنسجة مثل الجلد والأوعية الدموية والأوتار. وقد أجريت عمل واسع النطاق على الخواص الميكانيكية للالكولاجين 6-8، ولكن لم يكن هناك سوى عدد قليل من الدراسات على إعادة عرض الخلوية من المواد الهلامية الكولاجين أثناء نضوج ثابت. يشير إعادة عرض الخلوية إلى التعديلات الهيكلية للمصفوفة الكولاجين الناجم عن الخلايا التي يمكن أن تؤثر على استقرار الشبكة الألياف الكولاجين 9. كما سقالة الطبيعية، كميات كبيرة نسبيا من النوع الأول الكولاجين يمكن أن تكون معزولة، تعقيمها وتخزينها من مصادر مختلفة مثل الأوتار الفئران الذيل 10. فهم التفاعلات الخلوية مع الكولاجين والسلوكيات الميكانيكية العامة ذات الصلة السقالات الكولاجين cellularized (بنيات) هو خطوة أساسية لبناء الأنسجة. يمكن معالجتها TEBVs القائم على الكولاجين عن طريق خلط الخلايا مباشرة مع الكولاجينأثناء إعداد جل ومصبوب الى مزيد من الأشكال محددة مثل أنبوبي ومستو 11. خلايا الأوعية الدموية داخل الهلام تتكاثر واعادة تشكيلها نوع I الكولاجين 12. وهكذا، وهذه الطريقة تتجاوز الحاجة إلى macroporosity المحددة التي تمثل واحدة من القضايا الهامة في تطوير الاطر لتطبيقات هندسة الأنسجة. ومع ذلك، فإن العوائق الرئيسية من المواد الهلامية الكولاجين هي الخواص الميكانيكية منخفضة وذلك مقارنة مع المواد الاصطناعية (13).
في هذه الدراسة، تم تصميم الأنسجة قابلة للحياة مع توزيع متجانس من الخلايا عن طريق الاختلاط المباشر الكولاجين مع الخلايا في عملية من خطوة واحدة. واستخدمت "المفاعلات الحيوية الثابتة" ل1 أو 2 أسابيع من النضج ثابت من المواد الهلامية الكولاجين cellularized (بدون قيود الميكانيكية الحيوية الخارجية التطبيقية). خلال الثقافة، وقعت الكولاجين مصفوفة إعادة عرض، وبالتالي توفير التعزيز الهيكلي إلى بنيات. وعلاوة على ذلك، كانت هذه التركيبات صإيدي على أن يتم تحويلها إلى مفاعل حيوي الدورية الجدار وتم التوصل إلى البطانة متجانسة. بالإضافة إلى ذلك، في هذا العمل يقترح بروتوكول معين الاختبارات الميكانيكية أيضا إلى توفير نهج الرواية المناسب في وصف الخواص الميكانيكية للأنسجة الرخوة الأنبوبية.
وباختصار، فإن هذا العمل وسيلة لتصنيع ونضوج الأنسجة الوعائية التي هي قوية بما فيه الكفاية ليتم التعامل معها ليس فقط لالتوصيفات البيولوجية والميكانيكية، ولكن أيضا لمزيد من تكييف الميكانيكية في مفاعل حيوي ديناميكي، والتي تعتبر حاسمة السريع في المختبر خطوة في تجديد الأنسجة.
Protocol
Representative Results
Discussion
بين مجتمع المهندسين الأنسجة الوعائية، وقد تم القيام به جهودا جبارة لإعادة إنتاج طبقة وسائل الاعلام الغلالة المسؤولة عن الاستقرار الميكانيكي الأوعية الدموية 16. منذ العمل الرائد لواينبرغ وبيل 17، تم الكولاجين تستخدم على نطاق واسع سقالة لهندسة الأنسجة الوعائية لما له من توافق مع الحياة، خصائص غير المناعية ومدى توافرها. ومع ذلك، فإن استخدام الكولاجين يمثل تحديا كبيرا للباحثين، وهذه المواد ليس من السهل التعامل معها، نظرا لعدم وجود لا يتجزأ من صلابة ميكانيكية. التلاعب أثناء إعداد سقالة قد يؤدي إلى تلف السقالات، المساس بها لاستخدامها مرة أخرى.
تقنية الموضحة في هذا العمل يسمح: ط) لهندسة المواد الهلامية الكولاجين cellularized إلى الهندسة على شكل أنبوبي؛ الثاني) لهندسة الأنسجة البيولوجية قوية بما فيه الكفاية ليتم التعامل معها بعد فترة نضوج ثابتة قصيرة (1 أو 2 أسابيع)؛ الثالث) باسمالخواص الميكانيكية واللزجة sess هذه الأنسجة البيولوجية على شكل أنبوبي في 2 الاتجاهات. الخلايا في هلام تلعب دورا رئيسيا في إعادة عرض الكولاجين المصفوفة. خلال فترة النضج، أدت SMCS مقلص للضغط من المواد الهلامية مما أسفر عن بناء مع الاستقرار الميكانيكي العالي التي يمكن تقييمها في الاتجاهات الطولية والدائرية. بعد ذلك، المصنف HUVECs في الجانب اللمعية من بنيات لدت البطانة متجانسة وقابلة للحياة، مما يدل على صلاحية المواد الهلامية الكولاجين لتطبيقات هندسة الأنسجة الوعائية.
مفاعل حيوي المعروضة في هذا العمل وقد صمم خصيصا لتوفير بيئة مثلى لنمو الخلايا أثناء نضوج ثابت. وبالإضافة إلى ذلك، تم تصميم الأجهزة المتقدمة لتوصيف الخواص الميكانيكية واللزجة من بنيات بهدف الحد من أي أضرار محتملة الأصيل في التلاعبهذه المواد الحساسة. وبالتالي، تم تجهيز مفاعل حيوي ثابت من 0.22 ميكرون تصفية وغشاء مرشح على الغطاء (الخطوة 1.1.2، الشكل 1A وB) التي سمحت تبادل الغازات بين مستنبت داخل الخزان والحاضنة، مع الحفاظ على البيئة ثقافة عقيمة. وقد استخدم الحاجز بالتركيبة في الجزء السفلي كميناء لمستنبت أخذ العينات وتتغير خلال ثقافة ثابتة. بعض الخطوات الحاسمة يتعين النظر خلال تلفيق بناء والأوصاف. تم تنفيذ جميع التلاعبات (ينجز في الخطوة 2.1.1 والخطوات اللاحقة) التي قد تغير من عقم النظام في غطاء محرك السيارة البيولوجي العقيمة. تم معالجة الخلايا والكولاجين جل إعداد الخليط على الجليد من أجل تأخير عملية دبق (الخطوات 2.1.4 إلى 2.1.7). في خطوة 2.1.7، أي فقاعات الهواء المحبوسة في الخليط قبل دبق هي مناطق تركيز الضغط المحتملة التي يمكن أن تؤثر سلبا على الصورةtability من بنيات. لذلك، إزالة هذه فقاعات الهواء يتطلب تهز قليلا من التجمع أو باستخدام فراغ الطبية لمدة 3 دقائق لdegasing في ظروف معقمة. وأخيرا، تم تصميم السيطرة على وجه التحديد للحفاظ على محور مغزل المركزي في قالب أنبوبي خلال دبق والسماح التلاعب الدقيق للبنيات أثناء حصاد (إزالة مغزل، القسم 2.4)، لتبطنن، وتسهيل التركيب على النظام الميكانيكي (اختبارات طولية).
ويقترح هذا البروتوكول النهج الأصلي سهلة لعملية بديل من تعزيز المواد الهلامية الكولاجين يبني على أساس إمكانات مقلص الكامنة الطبيعية من SMCS. وتشمل التقنيات الشائعة لمصفوفات الكولاجين تعزيز استخدام وكلاء يشابك الفيزيائية والكيميائية التي يمكن أن يكون لها آثار ضارة على تفاعلات خلايا مصفوفة 18-20. تقنية تصنيع المقدمة فيهذا العمل يتيح توجيه هذه العملية إعادة مدفوعة الخلايا لانتاج بناء الأنسجة المهندسة مع الخواص الميكانيكية المستهدفة دون أي المعالجة الفيزيائية أو الكيميائية.
توصيف الخواص الميكانيكية والمواد الهلامية اللزجة الكولاجين المائية هو التحدي الكبير. في هذا المنظور، يصف هذا البروتوكول وسيلة بسيطة وفعالة الأصلي لتقييم الخواص الميكانيكية للأنسجة الرخوة الأنبوبية. هذا التوصيف يمكن القيام بها ليس فقط في الاتجاه المحيطي، ولكن أيضا في الاتجاه الطولي، مباشرة على هيكل أنبوبي كله. خلال توصيف الميكانيكية، ودرجة الحرارة، والبيئة المائية، ودرجة الحموضة والقوة الأيونية هي بعض العوامل البيئية التي هي معروفة لتؤثر بشكل كبير على السلوك الميكانيكي للالأنسجة البيولوجية 21. وبالتالي، فإن العمل الحالي يدل على وجود الأصلي انشاء وبروتوكول لتوصيف الميكانيكية من الأنسجة البيولوجية في غايةاستنساخه الزائفة الفسيولوجية البيئة (محلول ملحي في 37 ° C ودرجة الحموضة 7.4). إلى حد علمنا، لم يتم الإبلاغ عن هذا النوع من التوصيف في أماكن أخرى.
في الختام، التقنية المقترحة في هذا العمل يدل على قدرة عالية من الاختلاط المباشر للخلايا مع الكولاجين لتطبيقات هندسة الأنسجة الوعائية. هذه الطريقة مع توصيف وتبطنن عملية ميكانيكية تشكل بروتوكولات متعددة التكافؤ عالية. وبالتالي، من خلال تعديلات طفيفة من مجموعة عمليات والبروتوكولات مع الحفاظ على نفس المنطق، المتطلبات الرئيسية لهندسة الأنسجة الوعائية في حكمه ويمكن معالجة مثل معالجة سريعة وغير معقدة، بما في ذلك تبطنن، وإمكانية أن يكون نقلها إلى مجموعة واسعة من لينة الأنسجة مع مختلف الأطوال والأقطار. وعلاوة على ذلك، تختلف أنواع الخلايا الملتصقة، والبروتينات ECM وهندستها مصبوب يمكن التحقيق لعدد من تطبيق والمستهدفةإضافات، مثل الأوتار والهندسة، وترقيع الجلد، والبقع القلب والأعصاب وغيرها. على الرغم من أن الخواص الميكانيكية للبنيات مشجعة، إلا أنها لا تزال أقل من تلك الأنسجة الأصلية. في هذا السياق، ونحن نعتقد بقوة أن فترة النضج ثابتة قصيرة جدا هي خطوة حاسمة نحو تحفيز الحيوية في مفاعل حيوي، مما يؤدي إلى السلامة الهيكلية أعلى والاستقرار الميكانيكي. ومع ذلك، فإن إمكانية لإنتاج بسرعة cellularized يبني على أساس الكولاجين الأنسجة المهندسة مناسبة للأعمال الميكانيكية والنسيجية تحليلات يجعل مفاعل حيوي ثابت ووصفت الوثيقة أداة مفيدة واعدة لتوفير نظرة ثاقبة على التفاعل بين الخلايا وECM أثناء النمو وإعادة عرض، أو حتى ل أن تستخدم كنموذج لالعلاجات ونظم لتقديم الأدوية.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل هذا البحث من قبل مركز البحوث كيبيك CHU دي العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث وكندا، والمعهد الكندي للبحوث الصحية و.
Materials
| CellTreat 50 mL Bio-Reaction tubes | CELLTREAT Scientific Products | 229-475 | Centrifuge tube |
| Male luer with lock ring x 1/8" hose barb. PP. 25/pk | Cole Parmer | RK-45503-04 | Luer fittings for "gas-exchange port" |
| Female luer x 1/8" hose barb adapter. PP. 25/pk | Cole Parmer | RK-45500-04 | Luer fittings for the "medium sampling port" |
| Masterflex platinum-cured silicone tubing L/S 17. 25 ft. | Cole Parmer | RK-96410-17 | Tube 1 and 2 for the gauze grippers |
| Masterflex platinum-cured silicone tubing L/S 16. 25 ft. | Cole Parmer | RK-96410-16 | Tube 3 for the gauze grippers |
| Silastic Medical adhesive silicone, type A | Dow Corning | – | Silicon glue for the fabrication of the static bioreactor |
| Polyvent 4 Vessel venting filters | Whatman | 6713-0425 | Filter for "gas exchange port" |
| Rod. PP. stirring. 8’’ | Scienceware | 377660008 | Mandrel |
| Stopper silicone rubber 00 PK12 | VWR | 59590-084 | Stopper for the insertion of the mandrel to the vented cap of the centrifuge tube |
| Krytox PFPE/PTFE Greases | Dupont | GPL 202 | Medical grade grease for covering the mandrel |
| Trypsin-EDTA (0.5%) | Gibco | 15400-054 | Cell culture |
| Xiameter RTV-4130-J base and curing agent | Dow Corning | – | C-shaped silicone support for endothelialization |
| Dulbecco’s modified Eagle medium, DMEM, high glucose, pyruvate | Gibco (Life Technology) | 11995-065 | Cell culture |
| Pure acetone (99%) | Laboratoire Mat Inc. | AP0102 | Chemical for collagen extraction |
| Isopropyl alcohol (HPLC grade, 99.9%) | Fisher Scientific | AC610080040 | Chemical for collagen extraction |
| 0.02 N acetic acid (glacial acetic acid, HPLC grade, 99%; Fisher Scientific, | Fisher Scientific | FL070494 | Chemical for collagen extraction |
| Chloroform solution (99%) | Laboratoire Mat Inc. | CR 0179 | Chemical for collagen extraction |
| Hepes | Sigma-Aldrich | 163716 | Chemical for construct preparation |
| NaOH | Laboratoire Mat Inc. | SR-0169 | Chemical for construct preparation |
| LaserMike 136 | LaserMike | Series 183B | Scanning laser interferometer |
| ElectroPulse MicroTester | Instron Corporation | – | Micromechanical Tester |
| HyClone Media M199/EBSS, 500 mL | GE Healthcare Life Sciences | SH30253.01 | Component of cell culture medium |
| Fetal bovine serum HI – 500mL | Gibco | SH 30396.03 | Component of cell culture medium |
| Porcine serum (PS) | Sigma-Aldrich | P9783 | Component of cell culture medium |
| Penicillin-Streptomicin | Gibco | 15140-122 | Component of cell culture medium |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP661-50 | Saline solution |
| Tissue culture flask T17CN Vent Cap Red | Sarstedt Inc. | 83.1812.002 | Cell culture |
| ColorpHast- pH-indicator strips (pH=6.5-10.0) | EMD | 9583 | pH measurements |
| Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced, 5 mL vial | BD Biosciences – Discovery Labware | 356230 | Concentrate protein mixture for endothelialization process |
| LifeCam VX-3000 | Microsoft | – | Thickness measurement |
| Biochemical analyzer, DxC600 | Beckman Coulter Unicell Synchron | – | Glucose and lactate concentrations measurements |
| Collagen fibers | Rat tails | – | Collagen was extracted in the laboratory |
| Porcine smooth muscle cells (pSMCs) | Porcine aortas | – | pSMCs were isolated in the laboratory |
| Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) | Human umbilical veins | – | HUVECs were isolated in the laboratory |
Referências
- Kim, B. S., Nikolovski, J., Bonadio, J., Smiley, E., Mooney, D. J. Engineered smooth muscle tissues: regulating cell phenotype with the scaffold. Experimental cell research. 251, 318-328 (1999).
- Heureux, N., McAllister, T. N., de la Fuente, H. L. Tissue-engineered blood vessel for adult arterial revascularization. The New England journal of medicine. 357 (14), 1451-1453 (2007).
- Syedain, Z. H., Meier, L. A., Bjork, J. W., Lee, A., Tranquillo, R. T. Implantable arterial grafts from human fibroblasts and fibrin using a multi-graft pulsed flow-stretch bioreactor with noninvasive strength monitoring. Biomaterials. 32 (3), 714-722 (2011).
- Lee, C., Singla, A., Lee, Y. Biomedical applications of collagen. International journal of pharmaceutics. 221 (1-2), 1-22 (2001).
- Couet, F., Rajan, N., Mantovani, D. Macromolecular biomaterials for scaffold-based vascular tissue engineering. Macromolecular bioscience. 7 (5), 701-718 (2007).
- Christiansen, D. L., Huang, E. K., Silver, F. H. Assembly of type I collagen: fusion of fibril subunits and the influence of fibril diameter on mechanical properties. Matrix Biology. 19 (5), 409-420 (2000).
- Eppell, S. J., Smith, B. N., Kahn, H., Ballarini, R. Nano measurements with micro-devices: mechanical properties of hydrated collagen fibrils. Journal of the Royal Society, Interface / the Royal Society. 3 (6), 117-121 (2006).
- Lai, V. K., Lake, S. P., Frey, C. R., Tranquillo, R. T., Barocas, V. H. Mechanical behavior of collagen-fibrin co-gels reflects transition from series to parallel interactions with increasing collagen content. Journal of biomechanical engineering. 134 (1), 011004 (2012).
- Seliktar, D., Nerem, R. M., Galis, Z. S. The Role of Matrix Metalloproteinase-2 in the Remodeling of Cell-Seeded Vascular Constructs Subjected to Cyclic Strain. Annals of Biomedical Engineering. 29 (11), 923-934 (2001).
- Rajan, N., Habermehl, J., Coté, M. -. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nature protocols. 1 (6), 2753-2758 (2006).
- Kumar, V. A., Caves, J. M., et al. Collagen-Based Substrates with Tunable Strength for Soft Tissue Engineering. Biomaterials science. 1 (11), 1193-1202 (2013).
- Li, S., Van Den Diepstraten, C., D’Souza, S. J., Chan, B. M. C., Pickering, J. G. Vascular smooth muscle cells orchestrate the assembly of type I collagen via alpha2beta1 integrin, RhoA, and fibronectin polymerization. The American journal of pathology. 163 (3), 1045-1056 (2003).
- Badylak, S. F., Freytes, D. O., Gilbert, T. W. Extracellular matrix as a biological scaffold material: Structure and function. Acta biomaterialia. 5 (1), 1-13 (2009).
- Engbers-Buijtenhuijs, P., Buttafoco, L., et al. Biological characterisation of vascular grafts cultured in a bioreactor. Biomaterials. 27 (11), 2390-2397 (2006).
- Cheung, A. L. Isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). Current protocols in microbiology. 4, 4B (2007).
- Seifu, D. G., Purnama, A., Mequanint, K., Mantovani, D. Small-diameter vascular tissue engineering. Nature reviews. Cardiology. , (2013).
- Weinberg, C., Bell, E. A blood vessel model constructed from collagen and cultured vascular cells. Science. 231 (4736), 397-400 (1986).
- Meghezi, S., Chevallier, P., Mantovani, D. Why Mechanical Properties of Collagen Scaffolds Should Be Tested in a Pseudo-Physiological Environment. Advanced Materials Research. 409, 158-163 (2011).
- Tirella, A., Liberto, T., Ahluwalia, A. Riboflavin and collagen: New crosslinking methods to tailor the stiffness of hydrogels. Materials Letters. 74, 58-61 (2012).
- Madhavan, K., Belchenko, D., Tan, W. Roles of genipin crosslinking and biomolecule conditioning in collagen-based biopolymer: Potential for vascular media regeneration. Journal of biomedical materials research. Part A. , 16-26 (2011).
- Meghezi, S., Couet, F., Chevallier, P., Mantovani, D. Effects of a pseudophysiological environment on the elastic and viscoelastic properties of collagen gels. International journal of biomaterials. 2012, 319290 (2012).
