In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.
Синтетические материалы, как известно, чтобы инициировать клинических осложнений, таких как воспаление, стеноза, и инфекций при имплантации в сосудистых заменителей. Коллаген широко используется для широкого круга биомедицинских применений и считается реальной альтернативой синтетических материалов из-за присущей ей биосовместимость (т.е. низкой антигенности, воспаление и цитотоксические реакции). Тем не менее, ограниченные механические свойства и связанные с низким ручной способность коллагеновых гелей препятствовали их использование в качестве каркасных материалов для тканевой инженерии сосудов. Таким образом, обоснование этой работы был первым инженером cellularized гели коллагена в трубчатой формы геометрии и секунды, чтобы повысить гладкомышечных клеток приводом реорганизации коллагеновой матрицы для получения тканей достаточно жесткие, чтобы быть обработаны.
Стратегия, описанная здесь, основаны на непосредственном сборки коллагена и гладкомышечных клеток (построить) в 3D cylindrical геометрии с использованием технологии формования. Этот процесс требует определенного периода созревания, в течение которого конструкции культивировали в биореакторе в статических условиях (без приложенного внешнего динамических механических ограничений) в течение 1 или 2 недели. "Статический биореактор" обеспечивает управляемый и контролируемый стерильную среду (рН, температуры, газообмена, питательных веществ и удаления отходов) для конструкций. Во периода культивирования, толщина Измерения проводились для оценки клеток-приводом ремоделирование коллагеновой матрицы, и потребление глюкозы и лактата дебиты были измерены для контроля клеткам метаболической активности. Наконец, механические и вязкоупругих свойств были оценены в результате трубчатых конструкций. Для этого, конкретных протоколов и целенаправленной ноу-хау (манипуляции, захвата, работающих в среде гидратной и т.д.) были разработаны, чтобы охарактеризовать инженерных тканей.
Сосудистая тканевой инженерии предусматривает различные стратегии, направленные на изготовление инженерных судов, в том числе трансплантатов на основе синтетических лесов, тканевой инженерии клеток кровеносных сосудов листовой основе (TEBVs), и внеклеточного матрикса (ЕСМ) компоненты основе TEBVs. Среди этих подходов, синтетические полимеры обладают хорошими механическими свойствами, но имеют общую недостаток, поскольку они лишены биологической активности 1. Метод клеточной лист на основе позволяет получать инженерных сосудистых заменителей с высокими механическими свойствами, но время, необходимое для создания таких трансплантатов примерно 28 недель 2. Природные биополимеры ЕСМ, такие как коллаген, эластин, фибрин 3 или их сочетание, остается золотым стандартом материалы для тканевой инженерии каркасов. Это, прежде всего, по той причине, что эти материалы обладают в целом хорошую биосовместимость, находясь в состоянии вызвать функциональные клеточные ответы 4-5. Среди этих биополимерас, тип коллагена является одним из наиболее распространенных и преобладающей белка несущей ЕСМ во многих тканях, таких как кожа, кровеносные сосуды и сухожилия. Обширная работа была проведена на механические свойства коллагена 6 – 8, но там были только несколько исследований на клеточном ремоделирования коллагена гелей во время статического созревания. Сотовый ремоделирование относится к структурных модификаций коллагенового матрикса, индуцированного клеток, которые могут повлиять на стабильность коллагеновых фибрилл сети 9. В качестве естественного помост, относительно большое количество коллагена типа I могут быть выделены, стерилизуют и хранят из различных источников, таких как крысы хвост сухожилий 10. Понимание клеточных взаимодействий с коллагеном и связанные с ними общие механические поведения в cellularized коллагеновых каркасов (конструкции) является важным шагом для построения тканей. На основе коллагена TEBVs могут быть обработаны путем непосредственного смешивания клеток с коллагеномпри подготовке гель и далее формуют в конкретных формах, таких как трубчатых и плоских 11. Сосудистые клетки внутри гелей размножаться и тип реконструируют коллагена 12. Таким образом, этот метод обходит необходимость конкретной макропористости, что представляет собой один из важных вопросов в развитии лесов для тканевой инженерии. Тем не менее, основными недостатками коллагеновых гелей их низкие механические свойства по сравнению с синтетическими материалами 13.
В этом исследовании, жизнеспособной ткани с равномерным распределением клеток был разработан путем непосредственного смешивания коллагена с клетками в одностадийном процессе. "Статические биореакторы" были использованы для 1 или 2 недели статического созревания cellularized гелей коллагена (без приложенного внешнего динамических механических ограничений). В культуре, ремоделирование коллагеновой матрицы произошло, тем самым обеспечивая структурную подкрепление конструкций. Кроме того, эти конструкции были гEady должны быть переданы к вращающейся стенки биореактора и однородным эндотелия была достигнута. Кроме того, в этой работе специальный протокол механических испытаний Предлагается также обеспечить соответствующий новый подход в определении механических свойств трубчатых мягких тканей.
В целом, эта работа представляет собой метод для быстрого изготовления в пробирке и созревания сосудистых тканей, которые достаточно сильны, чтобы быть обработаны не только для биологических и механических характеристик, но и для дальнейшей механической кондиционирования в динамическом биореактор, который считается важным шаг в регенерации тканей.
Среди сообщества инженеров сосудистых тканей, огромные усилия были сделаны, чтобы воспроизвести Туника СМИ слой, отвечающий за механической стабильности кровеносных сосудов 16. Так пионерской работе Weinberg и Bell 17, коллаген широко используется в качестве каркаса для тканевой инженерии, потому что его биосовместимости, не иммуногенных свойств и доступности сосудов. Тем не менее, применение коллагена представляет собой большую проблему для исследователей, так как этот материал не прост в обращении, из-за отсутствия внутренней механической жесткости. Манипуляции при подготовке лесов может привести к повреждению лесов, ставя под угрозу их для дальнейшего использования.
Техника, описанная в этой работе позволяет: я), чтобы инженер cellularized гели коллагена в трубчатой формы геометрии; II) для проектирования биологических тканей достаточно сильны, чтобы быть обработаны после короткого периода созревания статического (1 или 2 недели); III) какСЭС механические и вязкоупругих свойств таких трубчатых-образные биологических тканей в 2-х направлениях. Клетки в геле играют ключевую роль в ремоделировании коллагенового матрикса. В течение периода созревания, сократительные ГМК привело к уплотнению гелей, дающих конструкцию с более высокой механической стабильностью, которые могут быть оценены в продольном и окружном направлениях. Впоследствии, HUVECs высевают в просвете стороне конструкции генерируется однородную и жизнеспособного эндотелий, демонстрируя тем самым пригодность коллагеновых гелей для тканевой инженерии сосудов.
Биореактор представлен в данной работе была специально разработана, чтобы обеспечить оптимальную среду для роста клеток при статическом созревания. Кроме того, устройства, разработанные для определения характеристик механических и вязкоупругих свойств конструкций были разработаны с целью уменьшить любое возможное повреждение, присущую манипуляциитакие нежные материалы. Следовательно, статические биореактор был оборудован по 0,22 мкм фильтр и мембранный фильтр на крышке (шаг 1.1.2, фиг.1А и В), что позволило газообмен между культуральной среды внутри резервуара и инкубатора, сохраняя стерильной среде культуры. Luer перегородки в нижней был использован в качестве порта для отбора проб питательной среды и изменения при статическом культуры. Некоторые важные шаги должны быть рассмотрены в ходе изготовления построить и характеристик. Все манипуляции, выполняемые (на этапе 2.1.1 и на последующих стадиях), что может изменить стерильность системы проводились в стерильных биологической капотом. Клетки и коллагеновый гель подготовка смесь обрабатывается на льду для того, чтобы задержать процесс желатинизации (шаги 2.1.4 до 2.1.7). На этапе 2.1.7, любые воздушные пузыри, захваченные в смеси до желатинизации являются потенциальными области концентрации напряжений, которые могут поставить под угрозу Sбильность конструктов. Таким образом, удаление таких воздушных пузырьков требует слегка встряхивая сборки или с помощью медицинской вакууме в течение 3 мин для дегазации в стерильных условиях. Наконец, захваты были специально разработаны для поддержания ось оправки центральной в трубчатой формы во время гелеобразования и позволяет тонкий манипуляции конструкций во время уборки (удаление оправки, раздел 2.4), для эндотелизации, и для облегчения монтажа на механическая система (продольные тесты).
Настоящий Протокол предлагает оригинальный альтернативный подход простой в процессе укрепления коллагеновых гелей конструкций на основе природного присущей сократительной потенциала ГМК. Общие методы коллагеновые матрицы усиления включать использование физических и химических сшивающих агентов, которые могут иметь вредные эффекты на клетки-матричных взаимодействий 18 – 20. Технология изготовления представлены вэта работа позволяет направлять эту клеток-приводом процесс ремоделирования с получением тканевой инженерии конструкцию с заданные механические свойства без физического или химической обработки.
Характеристика механических и вязкоупругих свойств гидратированных гелей коллагена является большой проблемой. С этой точки зрения, присутствует протокол описывает оригинальный простой и эффективный способ для оценки механических свойств трубчатых мягких тканей. Эта характеристика может быть выполнена не только в направлении по окружности, но также и в продольном направлении, непосредственно на всей трубчатой структуры. Во механических характеристик, температуры, водной среде, рН и ионной силы некоторые из экологических факторов, которые, как известно, существенно влияет на механические свойства биологических тканей 21. Следовательно, данная работа предполагает первоначальную настройку и протокол для механических характеристик биологических тканей в высоковоспроизводимым псевдо-физиологическом окружении (солевой раствор при 37 ° С и рН 7,4). Для нашим сведениям, этот вид характеристики никогда не были зарегистрированы в других местах.
В заключение, способ, предложенный в этой работе демонстрирует высокий потенциал прямого смешения клеток с коллагеном для тканевой инженерии сосудов. Этот метод вместе с механических характеристик и эндотелизации процесса составляют высокие поливалентные протоколы. Следовательно, через небольшие модификации наборов параметров и протоколов, сохраняя тот же обоснование, основные требования к ткани эквивалентов инженерно сосудистых могут быть решены, например, быстрого и несложного обработки, в том числе эндотелизации, и возможность быть перенесены на широкий спектр мягкой тканей с различной длины и диаметра. Кроме того, различные типы клеток адгезивные, белков ЕСМ и формованные геометрии могут быть исследованы для ряда целевых аппликациямидополнения, такие как инженерных сухожилий, кожных трансплантатов, сердечных патчи, нервов, среди других. Несмотря на то, что механические свойства конструкций обнадеживают, они все еще ниже, чем у нативных тканей. В этом контексте, мы уверены, что очень короткий период созревания статическое является решающим шагом на пути к динамической стимуляции в биореакторе, что приводит к более высокой структурной целостности и механической стабильности. Тем не менее, возможность быстро произвести тканевой инженерии cellularized на основе коллагена конструкции пригодны для механической и гистологический анализ делает статический биореактор, описанный здесь полезным и перспективным инструментом для обеспечения понимание взаимодействия между клетками и ECM во время роста и модернизации, или даже к быть использованы в качестве модели для лечения и системы доставки лекарственных средств.
The authors have nothing to disclose.
Это исследование было профинансировано естествознания и техники Научно-исследовательского совета Канады, Канадский институт исследований в области здравоохранения и научно-исследовательский центр Квебек ЧУ-де.
CellTreat 50 mL Bio-Reaction tubes | CELLTREAT Scientific Products | 229-475 | Centrifuge tube |
Male luer with lock ring x 1/8" hose barb. PP. 25/pk | Cole Parmer | RK-45503-04 | Luer fittings for "gas-exchange port" |
Female luer x 1/8" hose barb adapter. PP. 25/pk | Cole Parmer | RK-45500-04 | Luer fittings for the "medium sampling port" |
Masterflex platinum-cured silicone tubing L/S 17. 25 ft. | Cole Parmer | RK-96410-17 | Tube 1 and 2 for the gauze grippers |
Masterflex platinum-cured silicone tubing L/S 16. 25 ft. | Cole Parmer | RK-96410-16 | Tube 3 for the gauze grippers |
Silastic Medical adhesive silicone, type A | Dow Corning | – | Silicon glue for the fabrication of the static bioreactor |
Polyvent 4 Vessel venting filters | Whatman | 6713-0425 | Filter for "gas exchange port" |
Rod. PP. stirring. 8’’ | Scienceware | 377660008 | Mandrel |
Stopper silicone rubber 00 PK12 | VWR | 59590-084 | Stopper for the insertion of the mandrel to the vented cap of the centrifuge tube |
Krytox PFPE/PTFE Greases | Dupont | GPL 202 | Medical grade grease for covering the mandrel |
Trypsin-EDTA (0.5%) | Gibco | 15400-054 | Cell culture |
Xiameter RTV-4130-J base and curing agent | Dow Corning | – | C-shaped silicone support for endothelialization |
Dulbecco’s modified Eagle medium, DMEM, high glucose, pyruvate | Gibco (Life Technology) | 11995-065 | Cell culture |
Pure acetone (99%) | Laboratoire Mat Inc. | AP0102 | Chemical for collagen extraction |
Isopropyl alcohol (HPLC grade, 99.9%) | Fisher Scientific | AC610080040 | Chemical for collagen extraction |
0.02 N acetic acid (glacial acetic acid, HPLC grade, 99%; Fisher Scientific, | Fisher Scientific | FL070494 | Chemical for collagen extraction |
Chloroform solution (99%) | Laboratoire Mat Inc. | CR 0179 | Chemical for collagen extraction |
Hepes | Sigma-Aldrich | 163716 | Chemical for construct preparation |
NaOH | Laboratoire Mat Inc. | SR-0169 | Chemical for construct preparation |
LaserMike 136 | LaserMike | Series 183B | Scanning laser interferometer |
ElectroPulse MicroTester | Instron Corporation | – | Micromechanical Tester |
HyClone Media M199/EBSS, 500 mL | GE Healthcare Life Sciences | SH30253.01 | Component of cell culture medium |
Fetal bovine serum HI – 500mL | Gibco | SH 30396.03 | Component of cell culture medium |
Porcine serum (PS) | Sigma-Aldrich | P9783 | Component of cell culture medium |
Penicillin-Streptomicin | Gibco | 15140-122 | Component of cell culture medium |
Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP661-50 | Saline solution |
Tissue culture flask T17CN Vent Cap Red | Sarstedt Inc. | 83.1812.002 | Cell culture |
ColorpHast- pH-indicator strips (pH=6.5-10.0) | EMD | 9583 | pH measurements |
Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced, 5 mL vial | BD Biosciences – Discovery Labware | 356230 | Concentrate protein mixture for endothelialization process |
LifeCam VX-3000 | Microsoft | – | Thickness measurement |
Biochemical analyzer, DxC600 | Beckman Coulter Unicell Synchron | – | Glucose and lactate concentrations measurements |
Collagen fibers | Rat tails | – | Collagen was extracted in the laboratory |
Porcine smooth muscle cells (pSMCs) | Porcine aortas | – | pSMCs were isolated in the laboratory |
Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) | Human umbilical veins | – | HUVECs were isolated in the laboratory |