In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.
合成材料は、血管の代替物として移植した場合、炎症、狭窄、および感染症のような臨床的合併症を開始することが知られています。コラーゲンは、広範囲の生物医学的用途の広い範囲で使用されていると、その固有の生体適合性( すなわち 、低い抗原性、炎症、および細胞傷害性応答)の合成材料への有効な代替手段と考えられています。しかし、限られた機械的特性およびコラーゲンゲルの関連低手能力は、血管組織工学のための足場材料としてのそれらの使用を妨げてきました。したがって、この作品の背後にある論理的根拠を扱うことに十分に硬い組織を得るために、コラーゲンマトリックスの再編成を駆動平滑筋細胞を強化するために管状幾何形状と第二に細胞化コラーゲンゲルを設計した最初の。
ここで説明する戦略は、3D cyli中のコラーゲンや平滑筋細胞の直接組み立て(構築)に基づいています成形技術を用いてndricalジオメトリ。このプロセスは、構築物は、1または2週間(印加された外部の動的な機械的な制約なしに)静的な条件下でバイオリアクターにおいて培養される間、成熟期間を必要とします。 「静的なバイオリアクターは、「構築物監視、制御無菌環境(pH、温度、ガス交換、栄養素の供給と廃棄物の除去)を提供します。培養期間の間に、厚さの測定は、コラーゲンマトリックスのセル駆動型リモデリングを評価するために行った、グルコース消費量および乳酸産生速度、細胞代謝活性をモニターするために測定しました。最後に、機械的および粘弾性特性は、得られた筒状の構築物について評価しました。この目的のために、特定のプロトコルおよび集束ノウハウ(ように操作、把持、水和環境で作業、および)が操作された組織を特徴付けるために開発されました。
血管組織工学は、合成足場に基づいて移植片を含む操作された船の製造を目的とした様々な戦略、細胞シートベースの組織工学血管(TEBVs)、および細胞外マトリックス(ECM)成分をベースTEBVsを想定しています。これらのアプローチのうち、合成ポリマーは、良好な機械的特性を示すが、これらは生物活性を欠いている1として共通の欠点を共有します。細胞シートベースの方法は、高い機械的特性を有する操作された血管の代替物の生産を可能にするが、そのような移植片を生成するために必要な時間は、約28週2です。例えば、コラーゲン、エラスチン、フィブリン3またはそれらの組み合わせ、などのECMの天然の生体高分子は、組織工学の足場のためのゴールドスタンダード材料のまま。これは、主に機能的な細胞応答4-5を誘導することができながら、これらの材料は一般に良好な生体適合性を有することが理由です。これらの生体高分子のうち、S、I型コラーゲンは、皮膚、血管や腱などの多くの組織におけるECMの最も豊富で優勢な耐荷重タンパク質の一つです。大規模な作業は、コラーゲン6の機械的性質に行われている– 8が、静的な成熟中のコラーゲンゲルの細胞リモデリングにのみ少数の研究が行われています。細胞リモデリングは、コラーゲン原線維網9の安定性に影響を与える可能性が細胞によって誘発されるコラーゲンマトリックスの構造的修飾を指します。天然の骨格としては、I型コラーゲンの比較的大量には、ラット尾の腱10などの異なる供給源から単離され、滅菌および保存することができます。コラーゲンと細胞の相互作用と細胞化コラーゲン足場(構築物)の関連全体的な機械的挙動を理解することは、組織の構築に不可欠なステップです。コラーゲンベースTEBVs直接コラーゲンと細胞を混合することによって処理することができますゲル調製時に、さらに、このような筒状および平面11のような特定の形状に成形しました。ゲル内の血管細胞が増殖し、改造型は、私が12コラーゲン 。したがって、この方法は、組織工学用途のための足場の開発における重要な問題の一つを表し、特定のマクロ多孔性の必要性をバイパスします。しかし、コラーゲンゲルの主な欠点はそれらの低い機械的特性は、合成材料13と比較されます。
この研究では、細胞の均一な分布を有する生存組織は、1工程プロセスにおいて細胞とコラーゲンの直接混合することによって操作しました。 「静的バイオリアクター」は、(印加された外部動的機械的な制約なし)細胞化コラーゲンゲルの静的な成熟の1または2週間のために使用しました。培養中、コラーゲンマトリックスのリモデリングは、このように構築物の構造的補強を提供し、発生しました。また、これらの構築物は、rましたeady回転壁バイオリアクターに転送すると、均質な内皮を達成しました。また、この研究で特定の機械的試験のプロトコルは、管状の軟組織の機械的特性を特徴付けるに適切な新規のアプローチを提供することが提案されています。
要約すると、この作業は非常に重要であると考えられる生物学的および機械的特性評価のためだけでなく、動的なバイオリアクターのさらなる機械的条件付けのためだけでなく、取り扱いが十分強い血管組織のin vitroでの急速な製造および成熟のための方法を提示します組織の再生のステップ。
血管組織エンジニアのコミュニティの中でも、多大な努力が血管16の機械的安定性を担う中膜層を再現するために行われてきました。ワインバーグとベル17の先駆的研究以来、コラーゲンは広く、その生体適合性、非免疫原性と可用性の血管組織工学のための足場として使用されています。この材料は機械的剛性の固有の欠如に起因する、取り扱いが容易ではないしかし、コラーゲンの使用は、研究者にとって大きな課題です。足場の準備中の操作は、さらなる使用のためにそれらを犠牲に、足場を損傷する恐れがあります。
この作業に記載された技術は可能にする:i)は管状の形状に細胞化コラーゲンゲルを設計すること; ii)短い静的成熟期(1〜2週間)の後に処理されるのに十分に強い生体組織を設計する; III)と2方向のような管状の生体組織のSESの機械的および粘弾性特性。ゲル中の細胞は、コラーゲンマトリックスリモデリングにおいて重要な役割を果たす。熟成期間中、収縮性のSMCは、長手方向及び円周方向に評価することができ、より高い機械的安定性を有する構築物を得たゲルの圧縮をもたらしました。その後、HUVECを、したがって血管組織工学用途のためにコラーゲンゲルの適合性を実証し、均質な、生存内皮細胞を生成した構築物の管腔側に播種しました。
この研究で提示バイオリアクターは、具体的には、静的な成熟の間の細胞増殖のための最適な環境を提供するように設計されました。また、構築物の機械的及び粘弾性の特徴付けのために開発された装置は、操作に固有の任意の潜在的な損傷を低減する目的で設計されましたこのようなデリケートな素材。したがって、静的なバイオリアクターは、キャップの0.22μmフィルターとフィルター膜(ステップ1.1.2、 図1(a)の装備されていました およびB)無菌培養環境を維持しながら、培養リザーバ内の培地と培養器との間のガス交換を可能にしました。下部のルアーセプタムは、培地のサンプリング用ポートとして使用し、静的培養の間に変化しました。いくつかの重要なステップは、構築物の製造および特徴付けの際に考慮されなければなりません。システムの無菌性を変化させる可能性がある(ステップ2.1.1以降で実行される)すべての操作は無菌の生物学的フード内で行いました。細胞とコラーゲンゲル混合物の製造は、ゲル化プロセスを遅らせるために氷の上で処理された(2.1.7と2.1.4ステップ)。ステップ2.1.7では、ゲル化前に混合物中に閉じ込められた任意の気泡がsを損なう可能性が潜在的な応力集中領域であります構築物のtability。したがって、このような気泡の除去がわずかにアセンブリを振るか、無菌状態で脱気、3分間医療真空を使用する必要があります。最後に、グリップは、具体的には、ゲル化の間に筒状の金型内で、中心マンドレルの軸を維持するためと、(マンドレルの除去、セクション2.4)を収穫中の構築物の微妙な操作を可能にするため、内皮のために、およびへの実装を容易にするために設計されました機械システム(縦テスト)。
本プロトコルは、SMCの自然の固有の収縮の可能性に基づいて、コラーゲンゲル構造物の補強の元、簡単にプロセスの代替アプローチを提案しています。 20 –コラーゲンマトリックス強化材の一般的な技術は、細胞-マトリックス相互作用18に有害な影響を持つことができる物理的および化学的架橋剤の使用を含みます。に提示製造技術この作品は、任意の物理的又は化学的な処理をせずにターゲットを絞った機械的特性を有する組織工学構築物を得るために、この細胞主導のリモデリングプロセスを導くことができます。
水和コラーゲンゲルの機械的および粘弾性特性の特徴は、大きな課題です。この観点では、本プロトコルは、管状の軟組織の機械的特性を評価するための元のシンプルかつ効率的な方法を記載しています。この特徴付けは、直接全体管状構造に、周方向にも縦方向だけでなく行うことができます。機械的特性評価、温度、水性環境、pHおよびイオン強度の間大幅に生体組織21の機械的挙動に影響を及ぼすことが知られている環境要因の一部です。そこで、本研究は非常に生体組織の機械的特性評価のためのオリジナルのセットアップおよびプロトコルを提案します再現可能な擬似生理学的環境(37℃、pH7.4の食塩水)。我々の知る限り、特性のこの種は、他の場所で報告されていません。
結論として、本研究で提案された技術は、血管組織工学用途のためのコラーゲンと細胞の直接混合の高い可能性を示しています。機械的特性評価および内皮化プロセスと一緒に、この方法は、高多価のプロトコルを構成しています。したがって、同一の原理を維持しながらセットアップおよびプロトコルのわずかな改変を通して、工学血管組織等価物のための主な要件は、内皮化を含め、そのような迅速かつ単純な処理としてアドレス指定することができ、そして可能性がソフトの広範囲に転置します様々な長さと直径を有する組織。また、別の接着細胞タイプ、ECMタンパク質、成形形状は、標的アプリケーションシートの数を調査することができます例えば、特に工学腱、皮膚移植片、心臓パッチ、神経などのアドオン、。構築物の機械的特性は有望であるが、それらは、天然の組織のものよりも依然として低いです。この文脈において、我々は強く、非常に短い静的熟成期間がより高い構造的完全性および機械的安定性につながる、バイオリアクターへの動的な刺激に向けた重要なステップであると信じています。しかし、可能性は急速に機械的に適した組織工学細胞化コラーゲンベースの構築物を生成することが、組織学的、成長およびリモデリング、さらにはに間に細胞とECMの間の相互作用への洞察を提供するために有用であり、有望なツールは、本明細書に説明した静的バイオリアクターを作る分析します治療および薬物送達システムのためのモデルとして使用することができます。
The authors have nothing to disclose.
この研究は、自然科学とカナダの工学研究評議会、ヘルスリサーチのためのカナダの研究所CHUケベック研究センターによって資金を供給されました。
CellTreat 50 mL Bio-Reaction tubes | CELLTREAT Scientific Products | 229-475 | Centrifuge tube |
Male luer with lock ring x 1/8" hose barb. PP. 25/pk | Cole Parmer | RK-45503-04 | Luer fittings for "gas-exchange port" |
Female luer x 1/8" hose barb adapter. PP. 25/pk | Cole Parmer | RK-45500-04 | Luer fittings for the "medium sampling port" |
Masterflex platinum-cured silicone tubing L/S 17. 25 ft. | Cole Parmer | RK-96410-17 | Tube 1 and 2 for the gauze grippers |
Masterflex platinum-cured silicone tubing L/S 16. 25 ft. | Cole Parmer | RK-96410-16 | Tube 3 for the gauze grippers |
Silastic Medical adhesive silicone, type A | Dow Corning | – | Silicon glue for the fabrication of the static bioreactor |
Polyvent 4 Vessel venting filters | Whatman | 6713-0425 | Filter for "gas exchange port" |
Rod. PP. stirring. 8’’ | Scienceware | 377660008 | Mandrel |
Stopper silicone rubber 00 PK12 | VWR | 59590-084 | Stopper for the insertion of the mandrel to the vented cap of the centrifuge tube |
Krytox PFPE/PTFE Greases | Dupont | GPL 202 | Medical grade grease for covering the mandrel |
Trypsin-EDTA (0.5%) | Gibco | 15400-054 | Cell culture |
Xiameter RTV-4130-J base and curing agent | Dow Corning | – | C-shaped silicone support for endothelialization |
Dulbecco’s modified Eagle medium, DMEM, high glucose, pyruvate | Gibco (Life Technology) | 11995-065 | Cell culture |
Pure acetone (99%) | Laboratoire Mat Inc. | AP0102 | Chemical for collagen extraction |
Isopropyl alcohol (HPLC grade, 99.9%) | Fisher Scientific | AC610080040 | Chemical for collagen extraction |
0.02 N acetic acid (glacial acetic acid, HPLC grade, 99%; Fisher Scientific, | Fisher Scientific | FL070494 | Chemical for collagen extraction |
Chloroform solution (99%) | Laboratoire Mat Inc. | CR 0179 | Chemical for collagen extraction |
Hepes | Sigma-Aldrich | 163716 | Chemical for construct preparation |
NaOH | Laboratoire Mat Inc. | SR-0169 | Chemical for construct preparation |
LaserMike 136 | LaserMike | Series 183B | Scanning laser interferometer |
ElectroPulse MicroTester | Instron Corporation | – | Micromechanical Tester |
HyClone Media M199/EBSS, 500 mL | GE Healthcare Life Sciences | SH30253.01 | Component of cell culture medium |
Fetal bovine serum HI – 500mL | Gibco | SH 30396.03 | Component of cell culture medium |
Porcine serum (PS) | Sigma-Aldrich | P9783 | Component of cell culture medium |
Penicillin-Streptomicin | Gibco | 15140-122 | Component of cell culture medium |
Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP661-50 | Saline solution |
Tissue culture flask T17CN Vent Cap Red | Sarstedt Inc. | 83.1812.002 | Cell culture |
ColorpHast- pH-indicator strips (pH=6.5-10.0) | EMD | 9583 | pH measurements |
Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced, 5 mL vial | BD Biosciences – Discovery Labware | 356230 | Concentrate protein mixture for endothelialization process |
LifeCam VX-3000 | Microsoft | – | Thickness measurement |
Biochemical analyzer, DxC600 | Beckman Coulter Unicell Synchron | – | Glucose and lactate concentrations measurements |
Collagen fibers | Rat tails | – | Collagen was extracted in the laboratory |
Porcine smooth muscle cells (pSMCs) | Porcine aortas | – | pSMCs were isolated in the laboratory |
Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) | Human umbilical veins | – | HUVECs were isolated in the laboratory |