In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.
Les matériaux synthétiques sont connus pour lancer des complications cliniques tels que l'inflammation, la sténose, et les infections lorsqu'il est implanté en tant que substituts vasculaires. Le collagène a été largement utilisé pour un large éventail d'applications biomédicales et est considéré comme une alternative valable aux matériaux synthétiques en raison de sa biocompatibilité inhérente (par exemple, une faible antigénicité, l'inflammation et les réponses cytotoxiques). Cependant, les propriétés mécaniques limitées et la main basse-capacité connexe de gels de collagène ont entravé leur utilisation comme matériaux d'échafaudage pour l'ingénierie tissulaire vasculaire. Par conséquent, le raisonnement derrière ce travail fut le premier à concevoir des gels de collagène cellularisées dans une géométrie et une deuxième forme tubulaire pour améliorer les cellules musculaires lisses réorganisation menée de matrice de collagène pour obtenir les tissus suffisamment rigide pour être manipulé.
La stratégie décrite ici est basée sur l'assemblage direct de collagène et de cellules musculaires lisses (construction) dans un Cyli 3Dndrical géométrie à l'aide d'une technique de moulage. Ce procédé nécessite une période de maturation, au cours de laquelle les produits d'assemblage sont mises en culture dans un bioréacteur dans des conditions statiques (sans contraintes mécaniques dynamiques appliquées externes) pendant 1 ou 2 semaines. Le "bioréacteur statique" fournit un environnement stérile surveillé et contrôlé (pH, la température, les échanges gazeux, l'apport de nutriments et l'élimination des déchets) pour les constructions. Au cours de la période de culture, des mesures d'épaisseur ont été effectuées pour évaluer les cellules axée remodelage de la matrice de collagène, et la consommation de glucose et les taux de production de lactate ont été mesurées pour surveiller les cellules l'activité métabolique. Enfin, les propriétés mécaniques et viscoélastiques ont été évalués pour les constructions tubulaires résultant. A cet effet, des protocoles spécifiques et un savoir-faire focalisé (manipulation, de préhension, en travaillant dans un environnement hydraté, et ainsi de suite) ont été développées pour caractériser les tissus d'ingénierie.
Ingénierie tissulaire vasculaire envisage différentes stratégies visant à la fabrication de navires d'ingénierie, y compris les greffons synthétiques basés sur des échafaudages, des vaisseaux sanguins de l'ingénierie tissulaire à base de feuille de cellules (TEBVs), et de la matrice extracellulaire (MEC) TEBVs par composants. Parmi ces approches, les polymères synthétiques présentent de bonnes propriétés mécaniques, mais part un inconvénient commun qu'elles manquent de bioactivité 1. La méthode basée sur la feuille de cellules permet la production d'ingénierie substituts vasculaires avec des propriétés mécaniques élevées, mais le temps nécessaire pour produire ces greffes est d'environ 28 semaines 2. Biopolymères naturels de l'ECM, tels que le collagène, l'élastine, la fibrine 3 ou une combinaison de ceux-ci, restent les matériaux standard d'or pour les échafaudages d'ingénierie tissulaire. Ceci est principalement pour la raison que ces matériaux possèdent généralement bonne biocompatibilité tout en étant capable d'induire des réponses cellulaires fonctionnelles 4-5. Parmi ceux-ci biopolymères, collagène de type I est une protéine de la porteuse la plus abondante et la dominante de l'ECM dans de nombreux tissus comme la peau, les vaisseaux sanguins et les tendons. Un travail important a été effectué sur les propriétés mécaniques du collagène 6 – 8, mais il ya eu peu d'études sur le remodelage cellulaire de gels de collagène pendant la maturation statique. Le remodelage cellulaire désigne les modifications structurales de la matrice de collagène induite par les cellules qui pourraient affecter la stabilité du réseau de fibrilles de collagène neuf. Comme un échafaudage naturel, des quantités relativement importantes de collagène de type I peuvent être isolés, stérilisées et stockées à partir de différentes sources telles que les tendons de queue de rat 10. Comprendre les interactions cellulaires avec le collagène et les comportements mécaniques globales connexes des échafaudages de collagène cellularisées (des constructions) est une étape essentielle pour la construction des tissus. TEBVs à base de collagène peuvent être traitées en mélangeant directement les cellules avec du collagènelors de la préparation de gel et autre pièce moulée dans des formes spécifiques telles que tubulaire et plane 11. Cellules vasculaires à l'intérieur des gels prolifèrent et le type de remodelage du collagène 12. Ainsi, cette méthode contourne la nécessité de macroporosité spécifique qui représente l'un des problèmes importants dans le développement d'échafaudages pour les applications d'ingénierie tissulaire. Cependant, les principaux inconvénients des gels de collagène sont leurs propriétés mécaniques faibles par rapport aux 13 matières synthétiques.
Dans cette étude, un tissu viable avec une distribution homogène de cellules a été conçu par mélange direct de collagène avec des cellules dans un procédé en une étape. "bioréacteurs" statiques ont été utilisés pour les semaines de maturation statique des gels de collagène cellularisées 1 ou 2 (sans contraintes mécaniques dynamiques externes appliquées). Au cours de la culture, de la matrice de remodelage du collagène produite, offrant ainsi un renforcement structurel des constructions. En outre, ces constructions sont rEady à être transférés dans un bioréacteur rotatif, et une paroi endothélium homogène a été obtenue. En outre, dans ce travail un protocole mécanique spécifique de test est également proposé de fournir une nouvelle approche appropriée pour caractériser les propriétés mécaniques des tissus mous tubulaires.
En résumé, ce travail présente une méthode pour la fabrication et la maturation des tissus vasculaires qui sont assez fort pour être traitées non seulement pour les caractérisations biologiques et mécaniques, mais aussi pour le conditionnement ultérieur mécanique dans un bioréacteur dynamique, qui est considéré comme un élément crucial rapide in vitro l'étape dans la régénération des tissus.
Parmi la communauté des ingénieurs de tissus vasculaires, d'énormes efforts ont été fait pour reproduire la couche de tunique responsable de la stabilité mécanique des vaisseaux sanguins 16. Depuis les travaux pionniers de Weinberg et Bell 17, le collagène a été largement utilisé comme un échafaudage pour l'ingénierie des tissus vasculaires en raison de ses propriétés de biocompatibilité, non immunogènes et la disponibilité. Cependant, l'utilisation de collagène représente un grand défi pour les chercheurs, car ce matériau est pas facile à gérer, en raison de l'absence intrinsèque de rigidité mécanique. Manipulations pendant la préparation d'échafaudage peuvent endommager les échafaudages, les compromettre pour une utilisation ultérieure.
La technique décrite dans ce travail permet: i) à l'ingénieur des gels de collagène cellularisées dans une géométrie de forme tubulaire; ii) à l'ingénieur tissus biologiques assez fort pour être manipulés après une période de maturation statique courte (1 à 2 semaines); iii) commepropriétés mécaniques et viscoélastiques sess de ces tissus biologiques de forme tubulaire dans 2 directions. Les cellules dans le gel jouent un rôle clé dans le remodelage de la matrice de collagène. Au cours de la période de maturation, SMC contractiles ont conduit à la compaction des gels donnant une construction avec une stabilité mécanique plus élevée pouvant être évalués dans les directions longitudinale et circonférentielle. Ensuite, des cellules HUVEC ensemencées sur le côté luminal des constructions ont généré un endothélium homogène et viable, ce qui démontre l'aptitude des gels de collagène pour des applications d'ingénierie tissulaire vasculaires.
Le bioréacteur présenté dans ce travail a été spécifiquement conçu pour fournir un environnement optimal pour la croissance des cellules en cours de maturation statique. En outre, les dispositifs développés pour la caractérisation des propriétés mécaniques et viscoélastiques des constructions ont été conçues dans le but de réduire tout dommage potentiel inhérent à la manipulation deces matériaux délicats. Par conséquent, le bioréacteur statique a été équipé d'un filtre de 0,22 pm et une membrane de filtre sur le couvercle (étape 1.1.2, Figure 1A et B) qui a permis l'échange de gaz entre le milieu de culture à l'intérieur du réservoir et l'incubateur, tout en maintenant un milieu de culture stérile. La cloison à lumière en bas a été utilisé en tant que port de milieu de culture au cours de l'échantillonnage et la modification culture statique. Certaines étapes critiques doivent être considérées lors de la fabrication et construction caractérisations. Toutes les manipulations effectuées (dans l'étape 2.1.1 et dans les étapes suivantes) qui pourraient altérer la stérilité du système ont été effectuées dans une hotte biologique stérile. Cellules et gel de collagène préparation du mélange a été traité sur la glace afin de retarder le processus de gélification (étapes 2.1.4 à 2.1.7). A l'étape 2.1.7, des bulles d'air emprisonnées dans le mélange avant la gélification sont des zones de concentration des contraintes potentielles qui peuvent compromettre les sla rentabilité des constructions. Par conséquent, l'élimination de ces bulles d'air nécessite légèrement secouer l'ensemble ou en utilisant un vide médical pendant 3 min pour dégazer dans des conditions stériles. Enfin, les pinces ont été spécifiquement conçus pour le maintien de l'axe central du mandrin dans le moule tubulaire au cours de la gélification et pour permettre une manipulation délicate des produits d'assemblage pendant la récolte (enlèvement du mandrin, section 2.4), pour l'endothélialisation, et pour faciliter le montage sur le système mécanique (tests longitudinaux).
Le présent protocole propose une alternative approche originale et facile à processus de renforcement des gels de collagène constructions basé sur le potentiel de contraction inhérente naturelle des CML. Les techniques courantes de matrices de collagène renforcement impliquent l'utilisation d'agents de reticulation physiques et chimiques qui peuvent avoir des effets nuisibles sur les interactions cellules-matrice 18-20. La technique de fabrication présenté dansCe travail permet de diriger ce processus de remodelage cellules axée pour obtenir une construction de génie tissulaire avec des propriétés mécaniques ciblées sans aucun traitement physique ou chimique.
Caractérisation des propriétés mécaniques et viscoélastiques des gels de collagène hydraté est un grand défi. Dans cette perspective, le présent protocole décrit une méthode simple et efficace d'origine pour évaluer les propriétés mécaniques des tissus mous tubulaires. Cette caractérisation peut être effectuée non seulement dans la direction circonférentielle, mais également dans la direction longitudinale, directement sur l'ensemble de la structure tubulaire. Au cours de caractérisation mécanique, température, milieu aqueux, le pH et la force ionique sont certains des facteurs environnementaux qui sont connus pour affecter considérablement le comportement mécanique des tissus biologiques 21. Par conséquent, le présent ouvrage propose une mise en place et le protocole original pour la caractérisation mécanique des tissus biologiques dans un trèsreproductible pseudo-physiologique environnement (solution saline à 37 ° C et pH 7,4). Au meilleur de notre connaissance, ce genre de caractérisation n'a jamais été signalée ailleurs.
En conclusion, la technique proposée dans ce travail démontre le fort potentiel de mélange direct des cellules avec le collagène pour les applications d'ingénierie tissulaire vasculaires. Ce procédé ainsi que le procédé de caractérisation mécanique endothélialisation et constitue protocoles polyvalents élevées. Ainsi, grâce à de légères modifications des set-ups et des protocoles tout en gardant la même logique, les principales exigences pour les équivalents de tissus vasculaires d'ingénierie peuvent être abordés tels que le traitement rapide et simple, y compris endothélialisation, et la possibilité d'être transposé à un large éventail de doux tissus avec différentes longueurs et diamètres. En outre, différents types de cellules adhérentes, les protéines de l'ECM et géométries moulé peut être étudié pour un certain nombre de cibles applications, tels que les tendons d'ingénierie, les greffes de peau, les patchs, les nerfs cardiaques, entre autres. Bien que les propriétés mécaniques des constructions sont encourageants, ils sont encore inférieurs à ceux des tissus natifs. Dans ce contexte, nous croyons fermement que une période très courte statique de maturation est une étape cruciale vers la stimulation dynamique dans un bioréacteur, conduisant ainsi à une intégrité structurelle élevée et la stabilité mécanique. Toutefois, la possibilité de produire rapidement cellularisées constructions à base de collagène de l'ingénierie tissulaire approprié pour mécanique et histologique analyses rend le bioréacteur statique décrit ici un outil utile et prometteuse pour donner un aperçu de l'interaction entre les cellules et ECM pendant la croissance et le remodelage, ou même de être utilisé comme modèle pour des thérapies et des systèmes de délivrance de médicaments.
The authors have nothing to disclose.
Cette recherche a été financée par le Centre de recherche du CHU de Québec en sciences naturelles et en génie du Canada, l'Institut canadien de recherche en santé et.
CellTreat 50 mL Bio-Reaction tubes | CELLTREAT Scientific Products | 229-475 | Centrifuge tube |
Male luer with lock ring x 1/8" hose barb. PP. 25/pk | Cole Parmer | RK-45503-04 | Luer fittings for "gas-exchange port" |
Female luer x 1/8" hose barb adapter. PP. 25/pk | Cole Parmer | RK-45500-04 | Luer fittings for the "medium sampling port" |
Masterflex platinum-cured silicone tubing L/S 17. 25 ft. | Cole Parmer | RK-96410-17 | Tube 1 and 2 for the gauze grippers |
Masterflex platinum-cured silicone tubing L/S 16. 25 ft. | Cole Parmer | RK-96410-16 | Tube 3 for the gauze grippers |
Silastic Medical adhesive silicone, type A | Dow Corning | – | Silicon glue for the fabrication of the static bioreactor |
Polyvent 4 Vessel venting filters | Whatman | 6713-0425 | Filter for "gas exchange port" |
Rod. PP. stirring. 8’’ | Scienceware | 377660008 | Mandrel |
Stopper silicone rubber 00 PK12 | VWR | 59590-084 | Stopper for the insertion of the mandrel to the vented cap of the centrifuge tube |
Krytox PFPE/PTFE Greases | Dupont | GPL 202 | Medical grade grease for covering the mandrel |
Trypsin-EDTA (0.5%) | Gibco | 15400-054 | Cell culture |
Xiameter RTV-4130-J base and curing agent | Dow Corning | – | C-shaped silicone support for endothelialization |
Dulbecco’s modified Eagle medium, DMEM, high glucose, pyruvate | Gibco (Life Technology) | 11995-065 | Cell culture |
Pure acetone (99%) | Laboratoire Mat Inc. | AP0102 | Chemical for collagen extraction |
Isopropyl alcohol (HPLC grade, 99.9%) | Fisher Scientific | AC610080040 | Chemical for collagen extraction |
0.02 N acetic acid (glacial acetic acid, HPLC grade, 99%; Fisher Scientific, | Fisher Scientific | FL070494 | Chemical for collagen extraction |
Chloroform solution (99%) | Laboratoire Mat Inc. | CR 0179 | Chemical for collagen extraction |
Hepes | Sigma-Aldrich | 163716 | Chemical for construct preparation |
NaOH | Laboratoire Mat Inc. | SR-0169 | Chemical for construct preparation |
LaserMike 136 | LaserMike | Series 183B | Scanning laser interferometer |
ElectroPulse MicroTester | Instron Corporation | – | Micromechanical Tester |
HyClone Media M199/EBSS, 500 mL | GE Healthcare Life Sciences | SH30253.01 | Component of cell culture medium |
Fetal bovine serum HI – 500mL | Gibco | SH 30396.03 | Component of cell culture medium |
Porcine serum (PS) | Sigma-Aldrich | P9783 | Component of cell culture medium |
Penicillin-Streptomicin | Gibco | 15140-122 | Component of cell culture medium |
Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP661-50 | Saline solution |
Tissue culture flask T17CN Vent Cap Red | Sarstedt Inc. | 83.1812.002 | Cell culture |
ColorpHast- pH-indicator strips (pH=6.5-10.0) | EMD | 9583 | pH measurements |
Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced, 5 mL vial | BD Biosciences – Discovery Labware | 356230 | Concentrate protein mixture for endothelialization process |
LifeCam VX-3000 | Microsoft | – | Thickness measurement |
Biochemical analyzer, DxC600 | Beckman Coulter Unicell Synchron | – | Glucose and lactate concentrations measurements |
Collagen fibers | Rat tails | – | Collagen was extracted in the laboratory |
Porcine smooth muscle cells (pSMCs) | Porcine aortas | – | pSMCs were isolated in the laboratory |
Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) | Human umbilical veins | – | HUVECs were isolated in the laboratory |