لقد قمنا بتطوير اختبار تهيج العين التي تستخدم نموذج الأنسجة ثلاثي الأبعاد أعيد بناؤها مثل القرنية الطلائية البشري (RHCE). الاختبار هو قادرا على التمييز بين توتر العين والمواد المسببة للتآكل (GHS فئات 1 و 2 معا) وتلك التي لا تتطلب وضع العلامات (GHS لا الفئة).
ليتوافق مع التعديل السابع لقانون مستحضرات التجميل التوجيه والاتحاد الأوروبي REACH الاتحاد الأوروبي، وهناك حاجة إلى طرق بديلة غير حيوانية التحقق من صحة لتقييم موثوق ودقيق للسمية العين في الإنسان. لتلبية هذه الحاجة، قمنا بتطوير اختبار تهيج العين (EIT) الذي يستخدم الأبعاد أعيد بناؤها مثل القرنية الطلائية (RHCE) نموذج الأنسجة البشرية الثلاث التي تقوم على الخلايا البشرية العادية. وEIT غير قادرة على فصل المهيجات والمواد المسببة للتآكل العين (GHS فئات 1 و 2 معا) وتلك التي لا تتطلب وضع العلامات (GHS لا الفئة). اختبار يستخدم بروتوكولين منفصلين، أحدهما مصمم للمواد الكيميائية السائلة و، والبروتوكول الثاني مماثل لاختبار المواد الصلبة. يستخدم نموذج التنبؤ تمر اقتصاداتها بمرحلة انتقال فترة واحدة تعرض (30 دقيقة للسوائل، 6 ساعة للمواد الصلبة) وقابلية النسيج قطع واحد (60.0٪ كما يحددها فحص MTT). وبناء على نتائج 83 المواد الكيميائية (44 السوائل والمواد الصلبة 39) حقق EIT 95.5 / 68.2 / 81.8٪ والسناتورitivity / خصوصية ودقة (SS & A) للسوائل، 100.0 / 68.4 / 84.6٪ وSS & A للمواد الصلبة، و97.6 / 68.3 / 83.1٪ وعن العام SS & A. سوف EIT تسهم إسهاما كبيرا في تصنيف إمكانيات تهيج العين من مجموعة واسعة من المواد الكيميائية السائلة والصلبة من دون استخدام الحيوانات لتلبية متطلبات الاختبار التنظيمية. تم تنفيذ طريقة EpiOcular EIT في عام 2015 إلى المبادئ التوجيهية اختبار OECD كما TG 492.
المنتجات الاستهلاكية مثل مستحضرات التجميل والمنظفات، والمنظفات المنزلية وتشمل مجموعة متنوعة من المواد الكيميائية التي يمكن أن تسبب أضرارا خطيرة إذا ما اتصل العينين. لذلك، لا بد من اختبار هذه العوامل لتهيج العين من قبل الهيئات التنظيمية الأمريكية والاتحاد الأوروبي لضمان سلامة المستهلك 1. تقييما لاحتمال تهيج العين من الخلطات والتركيبات هو أيضا شرط للامتثال REACH (التسجيل والتقييم والتفويض، وتقييد المواد الكيميائية) تشريع لوضع العلامات من مكونات مستحضرات التجميل تحت توجيه الاتحاد الأوروبي مستحضرات التجميل لنقل المواد الكيميائية، ولل وسم المبيدات الحشرية والمنتجات المنزلية 2. حاليا، تتطلب الهيئات التنظيمية تقييم المخاطر العين باستخدام النظام المنسق عالميا لتصنيف المواد الكيميائية ووسمها (GHS) 3. ويستند GHS أساسا على اختبار دريز تهيج العين، وتهيج العين الأكثر استخداما على نطاق واسع في فحص المواد التي الأجنبية وميليتم إدخال xtures مباشرة في كيس الملتحمة من العين أرنب 4. وفقا لتصنيف GHS، GHS الفئة 1 (المواد المسببة للتآكل العين) يشير لاختبار المواد الكيميائية التي تسبب الإصابة الأولية الشديدة للأنسجة العين أو أضرار خطيرة للعين والرؤية التي ليس عكسها تماما في غضون 21 يوما بعد التعرض 3،5. GHS الفئة 2 يشير إلى اختبار المواد الكيميائية التي تنتج تغييرات كبيرة في العين التي هي عكسها تماما في غضون 21 يوما من التعرض. ويشار إلى المواد الكيميائية الاختبار التي ليست المواد المسببة للتآكل أو المهيجات باسم GHS لا الفئة.
لأكثر من 40 عاما، وقد انتقد اختبار أرنب العين دريز لافتقارها للاستنساخ، المبالغة في تقدير ردود فعل الإنسان، واستخدام الحيوانات الحية 5-8. وقد شجعت هذه المخاوف العديد من المقترحات لتحسينها، والحد، واستبدال اختبار في الجسم الحي 9. وتعززت الحاجة إلى بدائل غير حيوانية المصادق مزيدقبل اعتماد التعديل السابع لتوجيه مستحضرات التجميل، والتي حظرت استخدام الحيوانات في تقييم سلامة منتجات التجميل (في عام 2005) والمكونات (في عام 2009) 2.
منذ عام 1996، وقد نموذج الأنسجة مثل القرنية أعيد استخدامها على نطاق واسع من قبل صناعة مستحضرات التجميل لتقييم إمكانات تهيج المواد الخام، ومستحضرات القائم السطحي، وتتفاقم الخلطات التي تم تصميمها للاستخدام في، أو في محيط، والعين 10-13. استخدام نموذج الأنسجة RHCE يسمح التطبيق الموضعي المباشر للمواد الاختبار على سطح الأنسجة في شكله مخفف الأصلي. وبهذه الطريقة، يمكن اختبار تركيبات قابلة للذوبان غير المياه دون تمييعها مع المذيبات. ردا على EURL ECVAM في (المركز الأوروبي مختبر الاتحاد الأوروبي المرجعي للتحقق من الطرق البديلة) طلب طريقة للتطبيق على نطاق واسع، واضحة، والاقتصادي وتهيج اختبار العين (EIT) الذي يستخدم سينغلوقد وضعت ه وقت التعرض وغير قادرة على فصل المهيجات العين والمواد المسببة للتآكل من المواد التي لا تتطلب وضع العلامات (الشكل 1) 14. وبناء على نتائج 83 المواد الكيميائية (44 السوائل و39 المواد الصلبة)، حقق EIT 95.5 / 68.2 / و 81.8٪ الحساسية / خصوصية ودقة (SS & A) للسوائل، 100.0 / 68.4 / و84،6٪ SS & A للمواد الصلبة، و97،6 / 68.3 / 83.1٪ وعن العام SS & A.
في عام 2007، ودراسة ما قبل المصادقة متعددة مختبر ترعاه مستحضرات التجميل أوروبا (COLIPA سابقا) تحت رعاية ECVAM EURL تقييم مدى ملاءمة وموثوقية EIT بهدف الوصول بها إلى المصادقة رسميا 15. في هذه الدراسة، تم تنفيذ 298 محاكمات مستقلة في سبعة مختبرات مستقلة. وأظهرت نتائج الدراسة اتفاق 99،7٪ في التنبؤ مع معاملات منخفضة من الاختلاف في جميع المختبرات المشاركة 15. ونتيجة لذلك، في عام 2010 دخل بروتوكول تمر اقتصاداتها بمرحلة انتقال لEURL ECVAM رسميةبرنامج التحقق من الصحة. استخدمت الدراسة التحقق من صحة 104 الكيماويات اختبار مشفرة، بما في ذلك المواد الفردية والخلائط الكيميائية، والتي كانت في الجسم الحي البيانات المرجعية (دريز البيانات تهيج العين) المتاحة. وبناء على نجاح هذا العمل، قدم مشروع اختبار OECD التوجيهي في عام 2014. ومن المتوقع أن EIT سوف تسهم إسهاما كبيرا في تصنيف احتمال تهيج العين من مجموعة واسعة من المواد وفقا لتصنيف ووسم منظومة الأمم المتحدة GHS.
لقد قدم تهيج اختبار العين (الشكل 1) التي وضعت لنموذج الأنسجة EpiOcular. وEIT غير قادرة على فصل المهيجات والمواد المسببة للتآكل العين (GHS فئات 1 و 2 معا) من المواد التي لا تتطلب وضع العلامات (GHS لا الفئة) مع درجة عالية من الحساسية والنوعية 17. وEIT كما وردت في هذه الوثيقة لا تميز بين GHS الفئة 1 من الفئة 2 الكيميائية. تم التحقق من صحة EIT لتصنيف ووضع العلامات على احتمال تهيج العين من مجموعة واسعة من المواد الكيميائية، بما في ذلك مستحضرات التجميل والأدوية المكونات. بالتزامن مع الآخر في اختبارات المختبر، فإن EIT بمثابة بديل للفي الجسم الحي الأرنب العين اختبار تهيج.
يستخدم EIT بروتوكولين مماثلة ولكن متميزة للمواد السائلة والصلبة، والتي تختلف في طول التعرض وفترات الحضانة بعد التعرض لل(الشكل 1). نقطة النهاية المستخدمة في EITهي حيوية الأنسجة، والتي تحددها فحص MTT، والتي تم استخدامها سابقا في التحقق من صحة نماذج الأنسجة الظهارية الإنسان 20،21. لإجراء هذا الاختبار، ليس هناك حاجة إلى معدات خاصة بالإضافة إلى المعدات القياسية ثقافة الخلية. نظرا لمستوى عال من الأنسجة إلى أنسجة استنساخ، ن = 2 الأنسجة بدلا من عادة يوصى ن = تستخدم 3. القدرة على استخدام ن = 2 الأنسجة هو الجانب الحاسم من البروتوكول، لأنه يسمح للعامل من ذوي الخبرة لمعالجة اثنين من الأنسجة في وقت واحد، وبالتالي التقليل من تقلب الفحص التي يمكن أن تنشأ بسبب التعامل مختلفة من الأنسجة الفردية 14. أيضا، باستخدام ن = 2 الأنسجة في اختبار المادة، وتهيج من 10 مواد الاختبار من نفس الحالة الفيزيائية (سائلة أو صلبة)، جنبا إلى جنب مع الضوابط الإيجابية والسلبية، يمكن تقييمها باستخدام مجموعة واحدة (24 الأنسجة).
النقاط الرئيسية الأخرى التي تضمن تصنيف موثوق بها من مواد هي المواصفات لمراقبة إيجابية سوbstance (قابلية الأنسجة ≤50.0٪)، واستنساخ بين أنسجة مكررة (الفرق <20.0٪)، ومراقبة سلبية قراءات OD (> 0.8 و <2.5).
عند إجراء اختبار تمر اقتصاداتها بمرحلة انتقال، من المهم أن تلتزم بروتوكول التحقق من صحة والجرعات المقترحة والشطف جداول (الجداول 3 و 4)، لأن الانحراف عن بروتوكول أو تغييرات في فترات الحضانة قد يؤدي إلى نتائج غيرت. وبالمثل، فإن الانحرافات من الوقت 3 ساعات لMTT الحضانة يؤدي إلى قراءات مختلفة MTT ويمكن أن تؤثر نتيجة الفحص.
في بعض الأحيان، قد يكون مادة كيميائية اختبار الخصائص البصرية أو غيرها التي قد تتداخل مع الأنسجة MTT جدوى فحص أو سبب خفض MTT. على سبيل المثال، وهي مادة كيميائية اختبار قد يقلل بشكل مباشر MTT إلى الأزرق الأرجواني ناتج التفاعل، أو قد يكون عبارة عن مادة الملونة التي تمتص الضوء في نفس النطاق كما MTT formazan (~ 570 نانومتر). ومع ذلك، فإن هذه المواد الكيميائية اختبار العلاقات العامةESENT مشكلة فقط، إذا كان في ذلك الوقت من فحص MTT، كمية كافية من المواد لا تزال موجودة على (أو استيعابها من قبل) الأنسجة. لتجنب هذا التدخل، تدرج الإجراءات الشطف واسعة في بروتوكول تمر اقتصاداتها بمرحلة انتقال. إذا الشطف لا يزيل TA TA ويتداخل مع خفض MTT، يجب استخدام عناصر تحكم إضافية للكشف عن وصحيحة لذلك. باختصار، إذا كان يشتبه خفض MTT المباشر للمادة الكيميائية الاختبار، 50 ميكرولتر (أو 50 ملغ المواد الصلبة) من هذه المادة الكيميائية في السؤال هو المحتضنة لمدة 3 ساعات مع العمل الحل MTT في SCC (NC، 50 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات معقمة، يجب أن يكون تشغيل في نفس الوقت). إذا كان هذا الحل MTT إلى اللون الأزرق الأرجواني، يفترض المقال اختبار لقد قلل من MTT. في هذه الحالة فحص وظيفي باستخدام عناصر تحكم الأنسجة قتل تجميد ينبغي إجراء تقييم ما إذا كانت مادة الاختبار ملزما للأنسجة ويؤدي إلى تخفيض كاذبة إشارة MTT. إذا كان هناك انخفاض ملموس في MTT، ومراقبة الأنسجة TA مكشوفة قتل(نسبة لكمية في أنسجة قابلة للحياة غير المعالجة)، لا بد من تصحيح يعني بقاء الأنسجة من هذه المادة الاختبار عن طريق طرح الجدوى المتوسطة للسيطرة قتل.
وEIT يخطئ على جانب السلامة، كما يدل على ذلك حدوث انخفاض التصنيفات السلبية الكاذبة 14،15،18. الأهم من ذلك، أيا من المواد الكيميائية GHS الفئة 1، والتي هي تآكل للعين والتي تمثل الخطر العين الأكثر خطورة، تم تصنيفها على أنها غير مزعجة في هذا الاختبار 14،15،18،19. وأخيرا، واحدة من المزايا الرئيسية للRHCE في طريقة الاختبار في المختبر هو إمكانية اختبار السائل أنيق والمواد الصلبة (وهو أمر غير ممكن مع ثنائي الأبعاد، مزارع الخلايا المغمورة).
سوف EIT تسهم إسهاما كبيرا في تحديد احتمال تهيج العين من مجموعة واسعة من المواد وفقا لتصنيف ووسم منظومة الأمم المتحدة GHS. استبدال الحيوانات لتحديد سوكانت دائرية سمية هدف البحث السمية لسنوات عديدة. طريقة الاختبار تمر اقتصاداتها بمرحلة انتقال أكملت دراسة المصادقة الرسمية المعتمدة من قبل EURL ECVAM في عام 2014 ونفذ EpiOcular EIT في المبادئ التوجيهية اختبار OECD كما OECD TG 492 في عام 2015.
The authors have nothing to disclose.
فإن الكتاب أود أن أشكر الدكتور جون Harbell لدعمه العلمي والوقت المخصص للمشروع تمر اقتصاداتها بمرحلة انتقال. أيضا فإن الكتاب أود أن أشكر بيرسدورف AG (ألمانيا)، IIVS (الولايات المتحدة الأمريكية)، ماري كاي شركة (الولايات المتحدة)، آفون منتجات شركة (الولايات المتحدة الأمريكية)، وبروكتر أند غامبل / Cosmital (سويسرا)، مختبر بيار فابر (فرنسا)، مختبرات هارلان (المملكة المتحدة)، وLVMH برفوم (فرنسا) للمشاركة في موضوع الوسط الدولي قبل التحقق والتحقق دراسات عن تجارب تهيج العين 15.