Мы разработали раздражение глаз тест, который использует трехмерное реконструированное человека роговицы, как эпителиальные (RHCE) модель в ткани. Тест способен различать глазной раздражитель и агрессивных материалов (СГС Категории 1 и 2 комбинированных), и те, которые не требуют маркировки (СГС) Нет Категория.
В соответствии с седьмой поправкой к Директиве Косметика и REACH ЕС законодательство ЕС, утвержденные альтернативные методы без использования животных для надежной и точной оценки глазной токсичности человека необходимы. Чтобы удовлетворить эту потребность, мы разработали тест раздражение глаз (СПЭ), который использует трехмерную реконструированный человеческой роговицы, как эпителиальные (RHCE) тканей модель, основанную на нормальных человеческих клеток. СПЭ умеет отделять глазные раздражители и коррозионные (СГС Категории 1 и 2 комбинированных), и те, которые не требуют маркировки (СГС Нет категорию). Тест использует два отдельных протоколов, один, предназначенный для жидких химикатов и второй, аналогичной протокола для твердых исследуемых веществ. СПЭ модель прогнозирования использует один период экспонирования (30 мин для жидкостей, 6 ч для твердых веществ) и один жизнеспособности тканей отсечку (60,0%, как определено анализом МТТ). Основываясь на результатах для химических веществ 83 (44 жидкостей и 39 твердых веществ) СПЭ достигается 95,5 / 68.2 / 81,8% Sensitivity / специфичность и точность (СС & A), для жидкостей, 100,0 / 68,4 / 84,6% и СС и для твердых веществ, и 97,6 / 68,3 / 83,1% и для общего СС и А. ВНО будет значительно способствовать классификации раздражения глаз потенциал в широком диапазоне жидких и твердых химических веществ без использования животных для удовлетворения нормативных требований тестирования. Метод EpiOcular СПЭ был реализован в 2015 году в методики ОЭСР в TG 492.
Потребительские товары, такие как косметика, моющие средства, и бытовых чистящих средств включают в себя различные химические вещества, которые могут вызвать серьезные повреждения, если они входят в контакт глаза. Таким образом, тестирование этих агентов для раздражения глаз требуется регулирующих органов США и ЕС, чтобы обеспечить безопасность потребителей 1. Оценка глаза раздражения потенциала смесей и составов также является требованием для соблюдения REACH (регистрация, оценка, авторизация и ограничения химических веществ) законодательство для маркировки косметических ингредиентов в соответствии с Директивой ЕС Косметика для перевозки химических веществ, а также для маркировка пестицидов и бытовых товаров 2. В настоящее время регулирующие органы требуют оценки глазной опасности, используя на глобальном уровне системы классификации и маркировки химических веществ (СГС) 3. СГС основывается главным образом на раздражение глаз тест Драйзе, наиболее широко используемый раздражение глаз тест, в котором посторонние вещества и смесиxtures вводятся непосредственно в конъюнктивальный мешок глаза кролика 4. По классификации СГС, категория 1 СГС (глазные коррозионные) относится проверить химических веществ, которые вызывают тяжелые травмы первоначальный тканях глаза или серьезного повреждения глаз и зрения, которая не полностью исчезают в течение 21 дней после воздействия 3,5. СГС Категория 2 относится проверить химических веществ, которые производят значительные изменения в глазу, которые полностью исчезают в течение 21 дней после контакта. Тестовые химикаты, которые не коррозионные или раздражающие называют СГС без категории.
За более чем 40 лет, испытание глаза кролика Дрейза был подвергнут критике за отсутствие воспроизводимости, переоценке человеческих реакций, и использования живых животных 5-8. Эти опасения побудили многие предложения по совершенствованию работы, сокращения и замены в естественных условиях испытания 9. Необходимость проверенных альтернатив неживотного был дополнительно усиленпутем принятия поправки Седьмой к Директиве Косметика, который запретил использование животных в оценке безопасности косметической продукции (в 2005 году) и ингредиентов (в 2009 году) 2.
С 1996 года реконструированы модель ткани роговицы, как широко используется косметической промышленности для оценки раздражение потенциал сырья, препаратов на основе поверхностно-и усугубляется смесей, которые предназначены для использования в, или в непосредственной близости от, глаза 10-13. Использование модели RHCE ткани позволяет напрямую местное применение исследуемого материала на поверхность ткани в его родной, неразбавленном виде. Таким образом, не водорастворимые составы могут быть проверены без разбавления их растворителей. В ответ на Eurl ECVAM в (справочная лаборатория Европейского Союза Европейского центра по валидации альтернативных методов) запроса на широко применимым, простой и экономического метода Раздражение глаз тест (СПЭ), который использует оде время экспозиции и умеет отделять глазные раздражители и коррозионные из материалов, которые не требуют маркировки была разработана (рисунок 1) 14. На основании результатов 83 химических веществ (44 жидкостей и 39 твердых тел), то СПЭ достигается 95,5 / 68,2 / 81,8% чувствительность / специфичность и точность (SS & A) для жидкостей, 100.0 / 68.4 / и 84,6% SS & A для твердых и 97,6 / 68,3 / 83,1% и для общего СС и А.
В 2007, мульти-лабораторное исследование заранее проверка авторами Косметика Европы (ранее Colipa) под эгидой Eurl ECVAM оценили актуальность и надежность ВНО с целью приведения ее к формальному проверки 15. В этом исследовании, 298 независимых испытаний были выполнены в семи независимых лабораторий. Результаты исследования показали, 99,7% в прогнозировании соглашение с низкими коэффициентами вариации во всех участвующих лабораторий 15. В результате, в 2010 году СПЭ Протокол вступил официальное EURL ECVAMПрограмма проверки. Исследование проверка используется 104 кодированных тестов химических веществ, включая индивидуальных веществ и химических смесей, для которых в естественных условиях (справочные данные Дрейза данных раздражение глаз) были доступны. Основываясь на успехе этой работы, проект для тестирования Руководящие принципы ОЭСР был представлен в 2014 году ожидается, что СПЭ будет значительно способствовать классификации раздражения глаз потенциала широкого спектра материалов в соответствии с системы классификации и маркировки СГС ООН.
Мы представили раздражение глаз тест (рис 1), которая была разработана для модели EpiOcular ткани. СПЭ умеет отделять глазные раздражители и коррозионные (СГС Категории 1 и 2 вместе) из материалов, которые не требуют маркировки (СГС) без категории с высокой степенью чувствительности и специфичности 17. ЭИП, представленные здесь, не делает различий между СГС Категория 1 из 2 категории химикатов. ВНО была подтверждена для классификации и маркировки глазной раздражение потенциала широкого спектра химических веществ, в том числе косметических и фармацевтических ингредиентов. В сочетании с другом в пробирке тесты, ВНО будет служить в качестве замены для в естественных условиях кролик глаз испытания на раздражение.
СПЭ использует два похожих, но различных протоколов для жидких и твердых материалов, которые различаются по длине воздействия и после контакта инкубационных периодов (рисунок 1). Конечная точка используется в EITэто ткань жизнеспособность, определяется МТТ, который был ранее используемой в утвержденных человека эпителиальных тканей моделей 20,21. Для выполнения этого теста, никакого специального оборудования, кроме стандартного оборудования для культивирования клеток не требуется. В связи с высоким уровнем ткани к ткани, воспроизводимость N = 2 ткани вместо обычно рекомендуется п = 3 используются. Возможность использования N = 2 ткани является важным аспектом протокола, так как это позволяет опытным оператором обрабатывать два тканей одновременно, тем самым минимизируя изменчивость анализа, которые могут возникнуть из-за различных обработки отдельных тканей 14. Кроме того, с помощью N = 2 ткани на тест статьи, раздражения 10 испытуемых веществ одной и той же физическом состоянии (жидкие или твердые), наряду с положительным и отрицательным контролем, может быть оценена с помощью одного набора (24 тканей).
Другие ключевые моменты, которые обеспечивают надежную классификацию материалов спецификации для положительного контроля суbstance (ткань жизнеспособность ≤50.0%), воспроизводимость между дублирующих тканей (разница <20,0%), и отрицательный контроль показаний ОП (> 0,8 и <2,5).
При выполнении теста СПЭ, важно придерживаться утвержденной протоколом и в предлагаемом дозирования и промывки расписания (таблицы 3 и 4), так как отклонение от протокола или изменениях в инкубационных периодов может привести к измененной исходом. Точно так же, отклонения от времени 3 ч для МТТ инкубации будет приводить к различным показаниям МТТ и может повлиять на результат анализа.
Иногда тест может иметь химический оптические или другие свойства, которые могут помешать МТТ ткани жизнеспособность анализа или уменьшения вызывают МТТ. Например, тест может непосредственно химической восстанавливают МТТ в сине-фиолетовый продукта реакции или может быть цветным вещество, которое поглощает свет в том же диапазоне, МТТ формазана (~ 570 нм). Тем не менее, эти испытательные химикаты ргESENT проблему, только если в момент МТТ, достаточное количество материала по-прежнему присутствует на (или поглощается) ткань. Чтобы избежать этой помехи, обширные процедуры полоскание включены в ЭИП протокола. Если промывка не удалить TA и ТА мешает снижению МТТ, дополнительные элементы управления должны быть использованы для выявления и исправления для него. Вкратце, если прямого восстановления МТТ исследуемого вещества подозревается, 50 мкл (или 50 мг для твердых веществ) химического вещества в вопросе инкубируют в течение 3 ч с рабочим МТТ раствора при ГТК (штат Северная Каролина, 50 мкл стерильной деионизированной воды, должны быть работать одновременно). Если МТТ раствор становится сине-фиолетовый, тест статьи предполагается уменьшили МТТ. В этом случае функциональная проверка с помощью замораживания-убиты управления ткань должна быть выполнена, чтобы оценить, является ли исследуемый материал связывания с тканью и приводит к ложной сигнала уменьшения МТТ. Если есть снижение заметно МТТ в ТА-открытой, убитого контроля ткани(по отношению к количеству в необработанной ткани) жизнеспособной, среднее ткани жизнеспособность тестируемого изделия должна быть исправлена путем вычитания среднего жизнеспособность убитого управления.
ВНО допускает ошибку на стороне безопасности, как показано на низкой частоте ложных негативных классификаций 14,15,18. Важно отметить, что ни один из химических веществ, категория 1 СГС, которые разъедают глаза и которые не представляют наиболее серьезную опасность глазной, были классифицированы как не раздражает в этом анализе 14,15,18,19. Наконец, одним из основных преимуществ RHCE в пробирке методом испытаний является возможность тестирования аккуратный жидкости и твердые материалы (что не возможно с двумерными, погруженных культур клеток).
ВНО будет в значительной мере способствовать в определении раздражение глаз потенциал в широком диапазоне материалов в соответствии с системы классификации и маркировки СГС ООН. Замена животных, чтобы определить ососудистая токсичность была цель токсикологических исследований на протяжении многих лет. Метод испытания СПЭ завершила формальное изучение проверки поддерживаемый Eurl ECVAM в 2014 году и EpiOcular СПЭ был реализован в принципы испытаний ОЭСР в ТГ ОЭСР 492 в 2015 году.
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Джона Harbell его научной поддержки и времени, посвященного ЭИП проекта. Авторы также хотели бы поблагодарить Beiersdorf AG (Германия), IIVS (США), Mary Kay Inc. (США), Avon Products Inc. (США), Procter & Gamble / Cosmital (Швейцария), Laboratoire Pierre Fabre (Франция), Харлан лаборатории (Великобритания), и LVMH Парфюм (Франция) для участия в нескольких центр Международный Pre-Validation и валидации исследований глаз Раздражение Тест 15.