Nous avons développé un test d'irritation des yeux qui utilise un modèle de tissu tridimensionnel épithéliale reconstruit cornée comme humaine (RHCE). Le test est capable de discriminer entre irritation oculaire et des matériaux corrosifs (SGH Catégories 1 et 2 combinés) et ceux qui ne nécessitent pas d'étiquetage (SGH sans catégorie).
Pour se conformer à la septième amendement à la législation de l'UE Directive Cosmétique et de l'UE REACH, validées méthodes alternatives non animales pour l'évaluation fiable et précise de la toxicité oculaire chez l'homme sont nécessaires. Pour répondre à ce besoin, nous avons développé un test d'irritation des yeux (IET), qui utilise un modèle tridimensionnel reconstruit humaine cornée comme épithéliale (RHCE) tissu qui est basée sur des cellules humaines normales. L'IET est capable de séparer les irritants et corrosifs oculaires (SGH catégories 1 et 2 combinés) et ceux qui ne nécessitent pas d'étiquetage (SGH sans catégorie). Le test utilise deux protocoles séparés, l'un conçu pour des produits chimiques liquides et un deuxième protocole similaire pour les articles d'essai solides. Le modèle de prédiction IET utilise une seule période d'exposition (30 min pour les liquides, 6 heures pour les solides) et un seul la viabilité des tissus coupure (60,0% tel que déterminé par le test MTT). Basé sur les résultats de 83 produits chimiques (44 liquides et 39 solides) EIT atteint 95,5 / 68,2 / 81,8% et Sensibilité / spécificité et la précision (SS & A) pour les liquides, 100,0 / 68,4 / 84,6% et de SS & A pour les matières solides, et 97,6 / 68,3 / 83,1% et pour l'ensemble SS & A. L'IET contribuera de manière significative à classer le potentiel d'irritation oculaire d'un large éventail de produits chimiques liquides et solides, sans l'utilisation d'animaux pour satisfaire aux exigences d'essais réglementaires. La méthode EpiOcular IET a été réalisé en 2015 dans les directives de l'OCDE que TG 492.
Les produits de consommation tels que les cosmétiques, les détergents et produits de nettoyage domestiques comprennent une variété de produits chimiques qui peuvent provoquer des lésions graves si elles en contact avec les yeux. Par conséquent, les tests de ces agents pour irritation des yeux est requis par les organismes de réglementation des États-Unis et de l'UE pour assurer la sécurité des consommateurs 1. Une évaluation du potentiel d'irritation oculaire de mélanges et formulations est aussi une exigence de se conformer à REACH (enregistrement, évaluation, autorisation et restriction des produits chimiques) de la législation sur l'étiquetage des ingrédients cosmétiques en vertu de la directive européenne sur les cosmétiques pour le transport de produits chimiques, et pour l'étiquetage des pesticides et des produits ménagers 2. Actuellement, les organismes de réglementation exigent une évaluation de risque oculaire à l'aide du Système général harmonisé de classification et d'étiquetage des produits chimiques (SGH) 3. SGH est principalement basée sur le test d'irritation oculaire de Draize, test d'irritation des yeux le plus largement utilisé dans lequel les substances étrangères et mixtures sont introduits directement dans le sac conjonctival de l'oeil de lapin 4. Selon la classification SGH, SGH Catégorie 1 (corrosives pour l'œil) se réfère à tester les produits chimiques qui causent la blessure initiale sévère pour les tissus oculaires ou de graves dommages à l'œil et de la vision qui est pas totalement réversibles dans les 21 jours suivant l'exposition 3,5. SGH Catégorie 2 se réfère à tester les produits chimiques qui produisent des changements importants dans l'œil qui sont totalement réversibles dans les 21 jours d'exposition. Produits chimiques de test qui ne sont pas corrosifs ou irritants sont appelés SGH Non Catégorie.
Depuis plus de 40 ans, le test de Draize lapin a été critiqué pour son manque de reproductibilité, surestimation des réactions humaines, et l'utilisation d'animaux vivants 5-8. Ces préoccupations ont encouragé de nombreuses propositions pour le raffinement, la réduction et le remplacement de l'essai in vivo 9. La nécessité d'alternatives validées non animales a été renforcéepar l'adoption de la septième amendement à la directive sur les cosmétiques, qui interdit l'utilisation d'animaux dans l'évaluation de la sécurité des produits cosmétiques (en 2005) et des ingrédients (en 2009) 2.
Depuis 1996, le modèle de tissu de la cornée comme reconstruite a été largement utilisé par l'industrie cosmétique pour évaluer le potentiel d'irritation des matières premières, des formulations à base de tensioactifs, et les mélanges qui sont conçus pour une utilisation dans aggravée, ou dans le voisinage de l'oeil 10-13. L'utilisation du modèle de tissu RHCE permet une application topique directe du matériau d'essai sur la surface du tissu dans sa forme non diluée natif. De cette manière, des formulations solubles dans l'eau non peuvent être testées sans les diluer avec des solvants. En réponse à des EURL ECVAM (Union européenne Laboratoire de référence Centre européen pour le validation des méthodes alternatives) demande d'une méthode largement applicable, simple, économique et du test d'irritation des yeux (IET), qui utilise un single temps d'exposition et est en mesure de séparer les irritants et corrosifs oculaires à partir de matériaux qui ne nécessitent pas d'étiquetage a été développé (figure 1) 14. Basé sur les résultats de 83 produits chimiques (44 liquides et 39 solides), l'IET atteint 95,5 / 68,2 / 81,8% de sensibilité / spécificité et la précision (SS & A) pour les liquides, 100,0 / 68,4 / 84,6% de SS & A pour les matières solides, et 97,6 / 68,3 / 83,1% et pour l'ensemble SS & A.
En 2007, une étude de pré-validation multi-laboratoire parrainé par Cosmetics Europe (anciennement Colipa) sous les auspices de l'ECVAM EURL évalué la pertinence et la fiabilité de l'IET dans le but de l'amener à une validation formelle 15. Dans cette étude, 298 essais indépendants ont été effectués dans sept des laboratoires indépendants. Résultats de l'étude ont démontré un accord de 99,7% dans la prédiction avec de faibles coefficients de variation dans tous les laboratoires participants 15. En conséquence, en 2010, le protocole est entré dans une IET formelle EURL ECVAMprogramme de validation. L'étude de validation utilisé 104 produits chimiques d'essai codés, y compris les substances individuelles et les mélanges de produits chimiques, pour lesquels des données de référence in vivo (Draize de données d'irritation oculaire) étaient disponibles. Basé sur le succès de ce travail, un projet d'orientation test OCDE a été présenté en 2014. Il est prévu que l'IET contribuera de manière significative à la classification du potentiel d'irritation oculaire d'un large éventail de matériaux en fonction de la classification et de l'étiquetage SGH des Nations unies.
Nous avons présenté le test d'irritation des yeux (Figure 1) qui a été développé pour le modèle de tissu EpiOcular. L'IET est capable de séparer irritants oculaires et corrosifs (SGH Catégories 1 et 2 combinés) à partir de matériaux qui ne nécessitent pas d'étiquetage (SGH Sans catégorie) avec un haut degré de sensibilité et de spécificité 17. L'IET tel que présenté ici ne fait aucune discrimination entre SGH Catégorie 1 de la catégorie 2 produits chimiques. L'IET a été validé pour la classification et l'étiquetage du potentiel d'irritation oculaire d'un large éventail de produits chimiques, y compris les ingrédients cosmétiques et pharmaceutiques. En conjonction avec d'autres tests in vitro, l'IET servira de remplacement pour le test d'irritation in vivo sur œil de lapin.
L'IET utilise deux protocoles similaires, mais distinctes pour les matières liquides et solides, qui varient dans la durée d'exposition et de périodes d'incubation post-exposition (Figure 1). Le critère d'évaluation utilisé dans l'IETest la viabilité des tissus, déterminée par le test MTT, qui a été précédemment utilisé dans les modèles validés épithéliales humaines de tissu 20,21. Pour effectuer ce test, aucun équipement spécial en sus des équipements de culture cellulaire standard est nécessaire. En raison du niveau élevé de reproductibilité tissu à tissu, n = 2 au lieu de tissus généralement recommandé n = 3 sont utilisés. La possibilité d'utiliser n = 2 tissus est un aspect essentiel du protocole, car il permet à un opérateur expérimenté pour traiter simultanément deux tissus, minimisant ainsi la variabilité de l'essai qui peuvent survenir en raison de la différence de traitement des tissus individuels 14. Aussi, en utilisant n = 2 tissus par l'article de test, le caractère irritant de 10 substances d'essai du même état physique (liquide ou solide), avec les contrôles positifs et négatifs, peut être évaluée en utilisant un kit (24 tissus).
Autres points clés qui assurent classement fiable des matériaux sont des spécifications pour le contrôle positif substance (de la viabilité des tissus ≤50.0%), la reproductibilité entre les tissus en double (différence <20,0%), et des lectures de DO de contrôle négatif (> 0,8 et <2,5).
Lorsque vous effectuez le test IET, il est important de respecter le protocole validé et le dosage suggéré et les horaires de rinçage (tableaux 3 et 4), depuis déviation du protocole ou des changements dans les périodes d'incubation peut entraîner des résultats altérée. De même, les écarts de temps de 3 heures pour les MTT incubation se traduira par des lectures différentes de MTT et peuvent affecter résultat dosage.
Occasionnellement, un produit chimique d'essai peut avoir des propriétés optiques ou autres qui peuvent interférer avec le tissu de MTT test de viabilité ou la réduction de la cause de MTT. Par exemple, un produit chimique de test peut directement réduire MTT en produit de réaction bleu-violet, ou peut être une substance colorée qui absorbe la lumière dans la même gamme que MTT formazan (~ 570 nm). Cependant, ces produits chimiques d'essai seront prESENT un problème que, si, au moment du test MTT, une quantité suffisante du matériau est encore présent sur (ou absorbé par) le tissu. Pour éviter cette interférence, les procédures de rinçage vastes sont incorporés dans le protocole de l'IET. Si rinçage ne supprime pas le TA et le TA interfère avec réduction du MTT, des contrôles supplémentaires doivent être utilisés pour détecter et corriger pour elle. En bref, si la réduction de MTT directe de la substance d'essai est suspectée, 50 pi (ou 50 mg pour les solides) du produit chimique en question est incubé pendant 3 heures avec la solution de travail MTT au CSC (NC, 50 pi d'eau déminéralisée stérile, devrait être exécuter simultanément). Si la solution de MTT tourne bleu-violet, l'article de test est présumé avoir réduit le MTT. Dans ce cas, un contrôle fonctionnel en utilisant des commandes de tissus lyophilisés tué doit être effectuée afin d'évaluer si le matériel de test est obligatoire pour le tissu et menant à un faux signal de réduction du MTT. Si il ya réduction du MTT appréciable dans le, contrôle de tissu tué TA-exposée(par rapport à la quantité dans le tissu viable non traité), la viabilité des tissus moyen de l'article d'essai doit être corrigée en soustrayant la moyenne de la viabilité contrôle tué.
L'IET se trompe sur le côté de la sécurité, comme en témoigne la faible incidence des classifications faux négatifs 14,15,18. Surtout, aucun des produits chimiques SGH Catégorie 1, qui sont corrosives pour l'œil et qui représentent le plus grave risque oculaire, ont été classés comme non-irritant dans cet essai 14,15,18,19. Enfin, l'un des principaux avantages de la certification RHCE de méthode d'essai in vitro est la possibilité de tester liquide pur et matériaux solides (ce qui est impossible avec des cultures de cellules submergées deux dimensions).
L'IET contribuera de manière significative dans la détermination du potentiel d'irritation oculaire d'un large éventail de matériaux en fonction de la classification et de l'étiquetage SGH des Nations unies. Le remplacement des animaux pour déterminer oToxicité culier a été un objectif de la recherche toxicologique, depuis de nombreuses années. La méthode d'essai IET a complété une étude de validation formelle soutenue par EURL ECVAM en 2014 et a été mis en œuvre EpiOcular IET dans les Lignes directrices de l'OCDE que d'essai OCDE TG 492 en 2015.
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs tiennent à remercier le Dr John Harbell pour son soutien et le temps scientifique dédiée au projet IET. Les auteurs tiennent également à remercier Beiersdorf AG (Allemagne), IIVS (USA), Mary Kay Inc. (USA), Avon Products Inc. (USA), Procter & Gamble / Cosmital (Suisse), Laboratoire Pierre Fabre (France), Harlan Laboratories (Royaume-Uni), et LVMH Parfums (France) pour la participation au Multi-centre international de pré-validation et de validation des études du test d'irritation des yeux 15.