Sur mesure Microdialyse Probe Conception
Summary
Microdialyse est une technique couramment utilisée dans la recherche en neurosciences. Par conséquent sondes commerciales sont en grande demand.In ce travail un ensemble de sonde est expliqué en détail à construire une concentrique, sonde de microdialyse fiable, sur mesure pour moins de 10 $.
Abstract
Microdialyse est une technique couramment utilisée dans la recherche en neurosciences. Par conséquent sondes commerciales sont en grande demande pour surveiller les changements physiologiques, pharmacologiques et pathologiques dans le liquide céphalo-rachidien. Malheureusement, sondes commerciales sont coûteux pour les groupes de recherche dans les institutions publiques. Dans ce travail, un ensemble de sonde est expliqué en détail à construire une concentrique, sonde de microdialyse fiable, sur mesure pour moins de 10 $. La sonde de microdialyse est constitué d'une membrane en polysulfone avec un seuil de coupure moléculaire de 30 kDa. Probe in vitro recouvrements de substances ayant un poids moléculaire différent (dans la gamme de 100-1,600 Da) et différentes propriétés physico-chimiques sont comparées. La sonde donne un recouvrement d'environ 20% in vitro pour le petits composés de glucose, le lactate, l'acétylcholine et de l'ATP. In vitro recouvrements pour neuropeptides avec un poids moléculaire entre 1,000-1,600 Da montant à 2-6%. Ainsi, alors que le poids moléculaire plus élevéhuit des neuropeptides abaissé dans les valeurs de récupération in vitro, la dialyse de composés dans la fourchette basse (jusqu'à 500 Da) de poids moléculaires n'a pas grand impact sur le taux de récupération in vitro dans. Le présent procédé permet l'utilisation d'une membrane de dialyse avec une autre valeur de seuil et le matériau de membrane. Par conséquent, cet ensemble de sonde sur mesure a l'avantage de la souplesse suffisante pour dialyser substances dans une large gamme de poids moléculaire. Ici, on introduit une sonde de microdialyse avec une longueur d'échange de 2 mm, ce qui est applicable pour microdialyse dans les régions du cerveau de souris et de rat. Cependant, les dimensions de la sonde peuvent être facilement adaptés pour les grandes longueurs change pour être utilisé dans de plus grands animaux.
Introduction
Microdialyse est une technique couramment utilisée dans la recherche en neurosciences. Au cours des 50 dernières années, la technique de microdialyse minimale invasive a été continuellement amélioré pour devenir une méthode bien établie pour surveiller les concentrations locales de petits composés de poids moléculaire dans l'espace extracellulaire. Presque chaque fluide de tissu interstitiel peut être étudiée chez les animaux se déplacent librement.
Gaddum introduit la technique push-pull dans les années 1960. Il a modifié une approche de Feldberg et al. Dans laquelle tubocurarine a été perfusé à travers une canule qui se termine dans le ventricule latéral et en recueillant l'effluent également via une canule 1. Gaddum développé la technique push-pull dans lequel une canule constituée de deux aiguilles en acier concentriques a été implanté dans des zones distinctes du cerveau et perfusé par une solution tout en enlevant simultanément les neurotransmetteurs libérés par les neurones entourant la pointe 2. Malheureusement, dama de tissusge causé par la canule autour de la pointe a limité l'application de cette méthode. Comme autre avancement de ce procédé, Bito et ses collaborateurs ont introduit une méthode des sacs de dialyse, dans lequel la solution recueillie a été séparée du tissu environnant par une membrane de dialyse. Ils ont implanté un sac de dialyse dans le tissu sous-cutané de cou de chien. Le contenu du sac de dialyse est exempt de protéines et pourrait être analysée plusieurs semaines plus tard pour les ions et les acides aminés 3. L'étape suivante fut l'dialytrode, une sonde de microdialyse primitive, qui à l'origine a été décrit par Delgado en 1972 4. Enfin, Ungerstedt et ses collègues ont amélioré la conception de la sonde de microdialyse de sorte qu'il était plus petit et moins de tissu déplacé 5.
Une sonde de microdialyse concentrique se comporte comme un capillaire sanguin. Le système est continuellement perfusé par une solution présentant la composition ionique du liquide de tissu environnant tout en manquant de l'analyte d'intérêt. The membrane de dialyse est exposé à la solution ou le tissu externe est semi-perméable. Elle permet la diffusion passive de substances dans la sonde le long de leur gradient de concentration 6. La perméabilité dépend de nombreuses variables telles que le poids moléculaire, la forme, la charge et le pH du composé. Il est également limitée en raison des propriétés du matériau de la membrane, la taille des pores de la membrane et le taux 7 couler.
Les figures 1 et 2 montrent une sonde de microdialyse concentrique. Le liquide de perfusion pénètre par une tubulure d'entrée dans le manchon métallique, qui entoure la silice fondue. A l'intérieur du manchon métallique, il ruisselle le long de la silice fondue et le laisse sur sa pointe. Dans l'espace entre la membrane de dialyse et le polytétrafluoroéthylène (PTFE) -tubing (tel que du Téflon) le liquide de perfusion circule alors vers le haut. Ici, la diffusion de substances à partir du tissu se produit qui entourent la membrane. Le dialysat laisse la sonde à travers la PTFE-tubes, qui est reliée à la sortie des tubes et peuvent être collectées.
La technique de microdialyse a plusieurs avantages par rapport aux autres dans des techniques in vivo. La sonde constitue une barrière physique, de sorte que le dialysat contient pas d'enzymes ou de cellules. Par conséquent, il n'y a pas besoin de purification de l'éluat avant l'analyse, et aucune dégradation enzymatique des analytes a lieu. La dégradation par oxydation peut se produire pendant le passage de substances à analyser dans le tube, mais cela peut souvent être évitée en ajoutant un antioxydant (par exemple l'acide ascorbique) pour le perfusat. Sinon, les dommages oxydatifs à neuropeptides, par exemple, a été efficacement réprimée par le remplacement de la tubulure de sortie avec une pointe de recueillir le dialysat 8. Le dialysat peut être étudiée directement avec presque tout type de méthode analytique et des analytes multiples peuvent être collectées simultanément. Ce système peut être utilisé chez les animaux éveillés, et presque toutes les régions du cerveau peut êtreexaminé. En outre, la perfusion de médicaments à travers la sonde est possible (retrodialysis). Cependant, il existe aussi des limitations de la technique de microdialyse. La résolution temporelle peu faible ne fournit pas d'informations en temps réel concernant les changements de neurotransmetteurs. Parce qu'il est une technique invasive, sonde implantation provoque un traumatisme chirurgical et d'anesthésie, ce qui peut affecter les concentrations neurotransmetteurs, est requis lors de cette étape 7,9,10.
La concentration en substance dans le dialysat comprend seulement une petite quantité de la concentration du composé réel dans le fluide extracellulaire. Pour le calcul de la concentration du composé inconnu dans le liquide extracellulaire, par rapport récupération in vitro doit être calculée. Détermination de l 'individu dans recouvrements in vitro pour chaque sonde et chaque composé est nécessaire avant de commencer l'expérience in vivo. A cet effet, la sonde est plongée dans une solution contenant leanalyte d'intérêt alors que le liquide de perfusion est la même solution dépourvue de la substance à analyser d'intérêt. Après détermination des concentrations de composés dans le dialysat, ces données doit être soumis à leur concentration dans le fluide environnant. In vitro déterminations de récupération de plusieurs substances peuvent être mises en œuvre simultanément 9.
Beaucoup de groupes de recherche en neurosciences utilisent la technique de microdialyse pour enquêter sur les neurotransmetteurs et de métabolites dans l'espace extracellulaire des zones distinctes du cerveau. Ainsi, les sondes commerciales sont en grande demande dans l'environnement de la recherche en neurosciences. Un grand avantage de sondes disponibles dans le commerce est la fiabilité de fonctionnement élevée. Le dispositif expérimental pour les sondes commerciales est bien établi et validé pour de nombreux neurotransmetteurs et de métabolites connus. Cependant, alors que l'équipement de microdialyse disponible dans le commerce est coûteux et a moins de souplesse dans l'application 11, dans eest fonctionne un ensemble de sonde de microdialyse est présenté en détail, qui peut être adapté à toute application et peut être fabriqué pour moins de 10 $. Cette sonde sur mesure est une sonde de microdialyse concentrique testé pour les enquêtes dans différentes zones du cerveau 8.
Dans les recouvrements de la sonde in vitro de substances ayant des poids moléculaires différents (gamme de 100-1,600 Da) et avec différentes propriétés physico-chimiques sont comparées. In vitro de détermination de récupération de glucose, le lactate et l'acétylcholine avec un poids moléculaire inférieur à 200 Da, de l'ATP ayant un poids moléculaire d'environ 500 Da et le neuropeptides angiotensine II, substance P et la somatostatine avec un poids moléculaire supérieur à 1000 Da est exécutée.
Protocol
Representative Results
Discussion
La figure 3 montre un exemple de montage de la sonde. Dimensions de diamètre intérieur et extérieur correctes doivent être étroitement surveillés pour les tubes (1.6 mm OD; ID 350 um), la silice fondue (OD 105 um; ID 40 um) et la membrane de dialyse (DO 245 um; ID 210 um). Il est également important de maintenir un espace entre la membrane et de la silice fondue (105 pm) et entre la membrane et le tube (105 um), ainsi. Si les valeurs diffèrent, la pression dans la sonde peut augmenter et entraî…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors are grateful to G. Barka (SunChrom GmbH, Friedrichsdorf, Germany) for his support and for providing the epoxy glue. Furthermore, the authors acknowledge Fresenius Medical Care (Bad Homburg, Germany) for supplying the Capillary Haemodiafilter FXCorDiax. Funding was obtained from Goethe University of Frankfurt.
Materials
| Epoxy glue | SunChrom GmbH, Fiedrichsdorf, Germany | ||
| Fused silica ID 40 µm OD 105 µm | Ziemer-Chromatographie, Mannheim, Germany | Art. No: 6.040105 | |
| Polysulfone membrane (haemodialysis filter FX Cor Diax 600) | Fresenius Medical Care AG & Co. KGaA, Bad Homburg, Germany | REF: F00001593 | |
| Cyanacrylate glue (Pattex® superglue plastic) | Henkel AG&Co. KGaA, Düsseldorf, Germany | ||
| TEFLON-tubing 1.6 x 0.35 mm | SunChrom® GmbH, Friedberg, Germany | Art. No: 969-195.219 | |
| Scalpel (Feather® Surgical Blade No. 10) | pfm medical ag, cologne, Germany | Art. No: 07310 | |
| Microscope | MEIJI Techno | EMZ-8TR | |
| 30 G x 11" (0.3 x 25 mm) cannula Sterican® Z | B.Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | REF: 9324500 | |
| 25 G x 11/2" (0.5 x 40 mm) cannula 100 Sterican® | B.Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | REF: 9186166 | |
| Fine pen (Stabilo point 88 fine 0.4) | Schwan-STABILO Schwanhäußer GmbH & Co. KG | Art. No: 88/36 | |
| Hot glue (Glue sticks ULTRA Power x 11 mm) | Steinel® GmbH, Herzebrock-Clarholz, Germany | Art. No: 4007841046910 | |
| Sandpaper P60 230 x 280 | Robert Bosch GmbH, Gerlingen-Schillerhöhe, Germany | Catalog Number: 2608605397 |
Referências
- Feldberg, W., Malcom, J. Experiments on the site of action of tubocurarine when applied via the cerebral ventricles. J Physiol. 149, 58-77 (1959).
- Gaddum, J. H. Push-pull cannulae. J Physiol. 155 (1 P), (1961).
- Bito, L., Davson, H., Levin, E., Murray, M., Snider, N. The concentrations of free amino acids and other electrolytes in cerebrospinal fluid, in vivo dialysate of brain, and blood plasma of the dog. J Neurochem. 13 (11), 1057-1067 (1966).
- Delgado, J. M., Lerma, J., Martín del Río, R., Solís, J. M. Dialytrode technology and local profiles of amino acids in the awake cat brain. J Neurochem. 42 (5), 1218-1228 (1984).
- Ungerstedt, U., Pycock, C. Functional correlates of dopamine neurotransmission. Bull Schweiz Akad Med Wiss. 30 (1-3), 44-55 (1974).
- Ungerstedt, U. Microdialysis–principles and applications for studies in animals and man. J Intern Med. 230 (4), 365-373 (1991).
- Bourne, J. A. Intracerebral microdialys: 30 years as a tool for the neuroscientist. Clin Exp Pharmacol Physiol. 30 (1-2), 16-24 (2003).
- Lietsche, J., Gorka, J., Hardt, S., Karas, M., Klein, J. Self-built microdialysis probes with improved recoveries of ATP and neuropeptides. J Neurosci Methods. 237, 1-8 (2014).
- Chefer, V. I., Thompson, A. C., Zapata, A., Shippenberg, T. S. Overview of Brain Microdialysis. Curr Protoc Neurosci. 7, Unit 7.1 (2009).
- Neurochem, J. Brain Microdialysis. J. Neurochem. 52 (6), 1667-1679 (1989).
- Jolly, D., Vezina, P. In vivo microdialysis in the rat: low cost and low labor construction of a small diameter, removable, concentric-style microdialysis probe system. J Neurosci Methods. 68 (2), 259-267 (1996).
- Sumbria, R., Klein, J., Bickel, U. Acute depression of energy metabolism after microdialysis probe implantation is distinct from ischemia-induced changes in mouse brain. Neurochem Res. 36, 109-116 (2010).
