カスタムメイドマイクロダイアリシスプローブの設計
Summary
微小透析は、神経科学の研究で一般的に使用される技術です。したがって、商業的プローブは素晴らしいdemand.Inにプローブアセンブリは、10ドル未満のために信頼性の高い、同心、カスタムメイドの微小透析プローブを構築するために詳細に説明されているこの作品です。
Abstract
微小透析は、神経科学の研究で一般的に使用される技術です。したがって、商業的プローブは、脳脊髄液中の、生理的薬理学的および病理学的変化を監視するための大きな需要があります。残念ながら、商業的プローブは、公的機関の研究グループのために高価です。本研究では、プローブアセンブリは、10ドル未満のために信頼性の高い、同心、カスタムメイドの微小透析プローブを構築するために詳細に説明します。微小透析プローブは、30kDaの分子カットオフを有するポリスルホン膜で構成されています。プローブは、in vitro（100-1,600ダの範囲内の）異なる分子量、異なる物理化学的特性を有する物質の回収率が比較されています 。プローブは、低分子化合物のグルコース、乳酸塩、アセチルコリンおよびATPのための約20％のin vitroでの回復をもたらす。2〜6％に1,000-1,600ダ量との間の分子量を有する神経ペプチドのためのin vitroでの回収率。したがって、より高い分子W一方神経ペプチドの8がインビトロ回復値が低下し、分子量の低い範囲（最大500ダ）中の化合物の透析は、in vitroでの回収率には大きな影響を与えません。本発明の方法は、他のカットオフ値と膜材料と透析膜の使用を可能にします。したがって、このカスタムメイドのプローブアセンブリは、広い分子量範囲の物質を透析するのに十分な柔軟性の利点を有します。ここでは、マウスとラットの脳領域における微小透析に適用可能である2mmの交換長と微小透析プローブをご紹介します。しかし、プローブの寸法は簡単に、より大きな動物で使用する大きな交換長さに適合させることができます。
Introduction
微小透析は、神経科学の研究で一般的に使用される技術です。過去50年の間に、最小限の侵襲微小透析技術は、継続的に細胞外空間に低分子量化合物の局所濃度を監視するための十分に確立された方法になるように改善されました。ほぼすべての間質組織液が自由に動く動物で調べることができます。
Gaddumは、1960年代にプッシュプル法を導入しました。彼はフェルトベルグらからのアプローチを変更しました。ツボクラリンは側脳室で終わるカニューレを通して灌流カニューレ1を介して、また流出物を収集しました。 Gaddumは、2つの同心のスチール針からなるカニューレは別個の脳領域に移植し、同時にチップ2の周囲のニューロンから放出神経伝達物質を除去しながら液で灌流されたプッシュプル法を開発しました。残念ながら、組織DAMA先端の周りにカニューレによって引き起こさGEは、この方法の適用を制限しました。この方法のさらなる前進として、尾藤と共同研究者は、収集した溶液を透析膜によって周囲の組織から分離された透析バッグ法を導入しました。彼らは犬の首の皮下組織に透析嚢を移植しました。透析袋の内容は、無タンパク質であり、イオンおよびアミノ酸のための多くの3週間後に分析することができました。次の開発は、もともと1972年4デルガドによって記述された原始的な微小透析プローブ、dialytrodeだった。それは小さく、あまり組織5を変位となるように最後に、Ungerstedtらは微小透析プローブの設計を改善しました。
同心の微小透析プローブは、毛細血管と同じように動作します。システムは常に関心のある検体を欠くながら周囲の組織液のイオン組成をフィーチャー液で灌流されます。目外液または組織にさらされる電子の透析膜は半透過性です。それは、その濃度勾配6に沿ってプローブ内の物質の受動拡散を可能にします。透過性は、そのような化合物の分子量、形状、電荷およびpHなどの多くの変数に依存しています。また、膜材料、膜および流量7の孔サイズの特性に限定されます。
図1及び図2は、同心円状微小透析プローブを示します。灌流液は、溶融シリカを囲む金属スリーブ、への入口管を介して入ります。金属スリーブの内部では、溶融シリカに沿って下方に流れ、その先端にそれを残します。透析膜とポリテトラフルオロエチレン（PTFE）（例えばテフロンなど）-tubingとの間の空間に、灌流液は、その後、上方へ流れます。ここでは、組織からの物質の拡散は、膜を包囲するが発生します。透析液は、PTFを介してプローブを残しますチューブをコンセントに接続されており、回収することができるE-チューブ。
微小透析法は、 インビボ法の他に比べていくつかの利点を有します。プローブは透析液には酵素または細胞を含まない結果に物理的障壁を構成しています。したがって、そこに分析の前に溶出液の精製の必要がなく、分析物のない酵素分解は起こりません。酸化劣化は、チューブ中の分析物の通過の間に発生することができ、これは、多くの場合、灌流液に酸化防止剤（ 例えばアスコルビン酸）を添加することによって防止することができます。代替的に、神経ペプチドの酸化的損傷は、例えば、効率透析液8を収集するために先端で出口チューブを交換することによって抑制されました。透析液は、分析方法のほぼすべての種類を直接調査することができ、複数の分析物を同時に収集することができます。このシステムは、覚醒動物において使用することができ、ほぼすべての脳領域であることができます検討しました。また、プローブを通る薬剤の注入は（retrodialysis）が可能です。しかし、微小透析技術の限界もあります。やや低時間分解能は、神経伝達物質の変化に関するリアルタイムの情報を提供していません。それは、侵襲的技術であるため、プローブの移植は、外科的外傷および麻酔を引き起こす、神経伝達物質の濃度に影響を与えることができ、このステップ7,9,10の間に必要とされます。
透析液中の化合物濃度は、細胞外液中の実際の化合物の濃度のわずかな量を含みます。細胞外液中の未知の化合物濃度を計算するため、相対的なインビトロ回復を計算しなければなりません。個々のすべてのプローブのためのin vitroでの回収率の相対的な、すべての化合物の決意は、in vivoでの実験を開始する前に必要です。この目的のために、プローブを含有する溶液に浸漬します灌流液に対し、目的の分析物は、目的の分析物を欠く同じソリューションです。透析液中の化合物濃度を決意した後、このデータは、周囲の流体中のそれらの濃度に言及する必要がある。いくつかの物質のインビトロ回復測定を同時に実施することができる9。
多くの神経科学の研究グループは、異なる脳領域の細胞外空間内の神経伝達物質および代謝物を調査するために微小透析技術を使用しています。したがって、商業プローブが神経科学の研究環境に大きな需要があります。市販されているプローブの大きな利点は、高い機能性、信頼性です。商業プローブの実験設定は十分に確立されており、多くのよく知られた神経伝達物質および代謝物のために検証されます。しかし、市販の微小透析装置は高価であり、目に、アプリケーション11が少ない柔軟性を有するのに対し任意のアプリケーションに適合させることができ、10ドル未満のために製造することができる、微小透析プローブアセンブリが詳細に示されている作業です。このカスタムメイドのプローブは、様々な脳領域8内の調査のために試験同心微小透析プローブです。
異なる分子量（100-1,600ダの範囲）で、異なる物理化学的特性を比較すると物質のin vitro でのプローブの回収では 、分子量と分子量のグルコース、乳酸およびアセチルコリンのインビトロ回復決意200Da未満、ATP約500ダおよび神経ペプチドのアンジオテンシンII、千ダ上記分子量のサブスタンスPおよびソマトスタチンが行われます。
Protocol
Representative Results
Discussion
図3は、例示的なプローブアセンブリを示しています。正しい内側と外側の直径寸法は、密接にチューブのために観察されなければならない（OD 1.6ミリメートル、ID 350ミクロン）、溶融シリカ（OD 105ミクロン; ID 40ミクロン）と透析膜（OD 245ミクロン; ID 210ミクロン）。これは、膜および（105ミクロン）の溶融シリカとの間の空間を維持することも重要であると同様に（105ミク…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors are grateful to G. Barka (SunChrom GmbH, Friedrichsdorf, Germany) for his support and for providing the epoxy glue. Furthermore, the authors acknowledge Fresenius Medical Care (Bad Homburg, Germany) for supplying the Capillary Haemodiafilter FXCorDiax. Funding was obtained from Goethe University of Frankfurt.
Materials
| Epoxy glue | SunChrom GmbH, Fiedrichsdorf, Germany | ||
| Fused silica ID 40 µm OD 105 µm | Ziemer-Chromatographie, Mannheim, Germany | Art. No: 6.040105 | |
| Polysulfone membrane (haemodialysis filter FX Cor Diax 600) | Fresenius Medical Care AG & Co. KGaA, Bad Homburg, Germany | REF: F00001593 | |
| Cyanacrylate glue (Pattex® superglue plastic) | Henkel AG&Co. KGaA, Düsseldorf, Germany | ||
| TEFLON-tubing 1.6 x 0.35 mm | SunChrom® GmbH, Friedberg, Germany | Art. No: 969-195.219 | |
| Scalpel (Feather® Surgical Blade No. 10) | pfm medical ag, cologne, Germany | Art. No: 07310 | |
| Microscope | MEIJI Techno | EMZ-8TR | |
| 30 G x 11" (0.3 x 25 mm) cannula Sterican® Z | B.Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | REF: 9324500 | |
| 25 G x 11/2" (0.5 x 40 mm) cannula 100 Sterican® | B.Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | REF: 9186166 | |
| Fine pen (Stabilo point 88 fine 0.4) | Schwan-STABILO Schwanhäußer GmbH & Co. KG | Art. No: 88/36 | |
| Hot glue (Glue sticks ULTRA Power x 11 mm) | Steinel® GmbH, Herzebrock-Clarholz, Germany | Art. No: 4007841046910 | |
| Sandpaper P60 230 x 280 | Robert Bosch GmbH, Gerlingen-Schillerhöhe, Germany | Catalog Number: 2608605397 |
Referências
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