Por encargo Microdiálisis Sonda Diseño
Summary
La microdiálisis es una técnica muy utilizada en la investigación en neurociencias. Por lo tanto sondas comerciales están en gran demand.In esta obra un conjunto de sonda se explica en detalle la construcción de una sonda fiable, concéntrico a medida microdiálisis por menos de $ 10.
Abstract
La microdiálisis es una técnica muy utilizada en la investigación en neurociencias. Por lo tanto sondas comerciales tienen una gran demanda para monitorear los cambios fisiológicos, farmacológicos y patológicas en el líquido cefalorraquídeo. Por desgracia, las sondas comerciales son caros para los grupos de investigación en las instituciones públicas. En este trabajo, un conjunto de sonda se explica en detalle la construcción de una sonda fiable, concéntrico a medida microdiálisis por menos de $ 10. La sonda de microdiálisis se compone de una membrana de polisulfona con un corte molecular de 30 kDa. Sonda in vitro se comparan recuperaciones de sustancias con diferente peso molecular (en el intervalo de 100-1,600 Da) y diferentes propiedades fisicoquímicas. La sonda produce una recuperación in vitro de aproximadamente 20% para los compuestos pequeños glucosa, lactato, acetilcolina y ATP. En vitro recuperaciones para los neuropéptidos con un peso molecular entre 1.000-1.600 Da cantidad de 2-6%. Por lo tanto, mientras que la mayor w molecularocho de los neuropéptidos bajó pt los valores de recuperación in vitro, la diálisis de compuestos en el rango inferior (hasta 500 Da) de pesos moleculares no tiene gran impacto en la tasa de recuperación en vitro. El presente método permite la utilización de una membrana de diálisis con otro valor de corte y material de la membrana. Por lo tanto, este conjunto de la sonda a medida tiene la ventaja de la flexibilidad suficiente para dializar sustancias en una gama amplia de peso molecular. Aquí, se introduce una sonda de microdiálisis con una longitud de intercambio de 2 mm, que es aplicable para microdiálisis en regiones del cerebro de ratón y rata. Sin embargo, las dimensiones de la sonda se pueden adaptar fácilmente para longitudes de cambio más grandes para ser utilizado en animales más grandes.
Introduction
La microdiálisis es una técnica muy utilizada en la investigación en neurociencias. Durante los últimos 50 años, la técnica de microdiálisis mínimamente invasiva ha sido mejorada continuamente para convertirse en un método bien establecido para monitorear las concentraciones locales de compuestos de bajo peso molecular en el espacio extracelular. Casi cada fluido del tejido intersticial puede ser investigado en animales con libertad de movimientos.
Gaddum introdujo la técnica de vaivén en la década de 1960. Se modificó un enfoque de Feldberg et al. En la que tubocurarina se perfundió a través de una cánula termina en el ventrículo lateral y recoger el efluente también a través de una cánula 1. Gaddum desarrolló la técnica de vaivén en el que se implantó una cánula que consta de dos agujas de acero concéntricos en áreas del cerebro distintas y perfundido por una solución mientras se quita de forma simultánea los neurotransmisores liberados por las neuronas que rodean la punta 2. Desafortunadamente, dama de tejidoge causada por la cánula alrededor de la punta limita la aplicación de este método. Como un avance adicional de este método, Bito y compañeros de trabajo introdujeron un método de la bolsa de diálisis en el que la solución recogida se separó del tejido circundante por una membrana de diálisis. Se implantaron un saco de diálisis en el tejido subcutáneo de los cuellos de perro. El contenido de la bolsa de diálisis es libre de proteínas y podría analizarse muchas semanas más tarde para los iones y aminoácidos 3. El siguiente desarrollo fue el dialytrode, una sonda de microdiálisis primitivo, que originalmente fue descrito por Delgado en 1972 4. Finalmente, Ungerstedt y colegas mejoró el diseño de sonda de microdiálisis de modo que era más pequeño y menos tejido desplazado 5.
Una sonda de microdiálisis concéntrico comporta de manera similar a un capilar de sangre. El sistema está constantemente perfundida por una solución con la composición iónica del fluido tejido circundante mientras que carecen del analito de interés. The membrana de diálisis expuesta a la disolución o tejido externa es semi-permeable. Se permite la difusión pasiva de las sustancias en la sonda a lo largo de su gradiente de concentración 6. La permeabilidad depende de muchas variables tales como el peso molecular, forma, carga y pH del compuesto. También está limitado debido a las propiedades del material de la membrana, tamaño de poro de la membrana y la tasa de 7 fluir.
Las figuras 1 y 2 muestran una sonda de microdiálisis concéntrica. El líquido de perfusión entra a través de un tubo de entrada en el manguito de metal, que rodea la sílice fundida. Dentro de la funda de metal, que fluye a lo largo de la sílice fundida y lo deja en la punta. En el espacio entre la membrana de diálisis y el politetrafluoroetileno (PTFE) -tubing (tal como Teflón) el fluido de perfusión a continuación, fluye hacia arriba. Aquí, la difusión de sustancias desde el tejido se produce que rodean la membrana. El dializado sale de la sonda a través de la PTFE-tubo, que está conectado al tubo de salida y se puede recoger.
La técnica de microdiálisis tiene varias ventajas con respecto a otros pt técnicas in vivo. La sonda constituye una barrera física con el resultado de que el dializado no contiene enzimas o células. Por lo tanto, no hay necesidad de purificación del eluato antes del análisis, y no la degradación enzimática de los analitos se lleva a cabo. La degradación oxidativa puede ocurrir durante el paso de analitos en el tubo, pero esto a menudo puede ser evitado mediante la adición de un antioxidante (por ejemplo, ácido ascórbico) al perfundido. Alternativamente, el daño oxidativo a neuropéptidos, por ejemplo, se suprimió de manera eficiente mediante la sustitución de la tubería de salida con una punta para recoger el dializado 8. El dializado se puede investigar directamente con casi cualquier tipo de método analítico y múltiples analitos se pueden recoger de forma simultánea. Este sistema puede ser utilizado en animales despiertos, y casi todas las regiones del cerebro puede serexaminado. Por otra parte, la infusión de medicamentos a través de la sonda es posible (retrodialysis). Sin embargo, también hay limitaciones de la técnica de microdiálisis. El tiempo de resolución algo baja no proporciona información en tiempo real sobre los cambios de neurotransmisores. Debido a que es una técnica invasiva, la implantación de la sonda provoca trauma quirúrgico y la anestesia, que puede afectar a las concentraciones de neurotransmisores, se requiere durante este paso 7,9,10.
La concentración del compuesto en el dializado comprende sólo una pequeña cantidad de la concentración del compuesto real en el líquido extracelular. Para el cálculo de la concentración de compuesto desconocido en el líquido extracelular, relativa recuperación in vitro tiene que ser calculado. Determinación de la relación individuo pt recuperaciones in vitro para cada sonda y cada compuesto es necesario antes de comenzar el experimento in vivo. Para este propósito, la sonda se sumerge en una solución que contiene elanalito de interés mientras que el fluido de perfusión es la misma solución que carece del analito de interés. Después de la determinación de concentraciones de compuesto en el dializado, esta información tiene que ser refiere a su concentración en el fluido circundante. En vitro determinaciones de recuperación de varias sustancias se pueden implementar simultáneamente 9.
Muchos grupos de investigación neurociencia utilizan la técnica de microdiálisis para investigar los neurotransmisores y metabolitos en el espacio extracelular de las áreas del cerebro distintas. Por lo tanto, las sondas comerciales tienen una gran demanda en el entorno de la investigación en neurociencias. Una gran ventaja de las sondas disponibles comercialmente es la fiabilidad funcional alta. El montaje experimental para sondas comerciales está bien establecido y validado para muchos neurotransmisores y metabolitos conocidos. Sin embargo, mientras que el equipo de microdiálisis disponible comercialmente es caro y tiene menos flexibilidad en la aplicación 11, en THes trabajar un conjunto de sonda de microdiálisis se presenta en detalle, que puede adaptarse a cualquier aplicación y puede ser fabricado por menos de 10 dólares. Esta sonda a medida es una sonda de microdiálisis concéntrica probado para las investigaciones en diversas áreas cerebrales 8.
En recuperaciones de sonda in vitro de sustancias con peso molecular diferente (gama de 100-1,600 Da) y se comparan con diferentes propiedades fisicoquímicas. Determinación in vitro de recuperación de la glucosa, el lactato y la acetilcolina con un peso molecular inferior a 200 Da, ATP con un peso molecular de aproximadamente 500 Da y el neuropéptidos de la angiotensina II, la sustancia P y la somatostatina con un peso molecular por encima de 1.000 Da se realiza.
Protocol
Representative Results
Discussion
La Figura 3 muestra un conjunto de sonda ejemplar. Cotas de diámetro interior y exterior Corregir tienen que ser cuidadosamente monitorizados por tubo (OD 1,6 mm; ID 350 micras), sílice fundida (OD 105 m; ID 40 micras) y la membrana de diálisis (OD 245 m; ID 210 micras). También es importante mantener un espacio entre la membrana y la sílice fundida de (105 m) y entre la membrana y el tubo (105 micras) también. Si los valores son diferentes, la presión en la sonda puede elevarse y producir la pé…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors are grateful to G. Barka (SunChrom GmbH, Friedrichsdorf, Germany) for his support and for providing the epoxy glue. Furthermore, the authors acknowledge Fresenius Medical Care (Bad Homburg, Germany) for supplying the Capillary Haemodiafilter FXCorDiax. Funding was obtained from Goethe University of Frankfurt.
Materials
| Epoxy glue | SunChrom GmbH, Fiedrichsdorf, Germany | ||
| Fused silica ID 40 µm OD 105 µm | Ziemer-Chromatographie, Mannheim, Germany | Art. No: 6.040105 | |
| Polysulfone membrane (haemodialysis filter FX Cor Diax 600) | Fresenius Medical Care AG & Co. KGaA, Bad Homburg, Germany | REF: F00001593 | |
| Cyanacrylate glue (Pattex® superglue plastic) | Henkel AG&Co. KGaA, Düsseldorf, Germany | ||
| TEFLON-tubing 1.6 x 0.35 mm | SunChrom® GmbH, Friedberg, Germany | Art. No: 969-195.219 | |
| Scalpel (Feather® Surgical Blade No. 10) | pfm medical ag, cologne, Germany | Art. No: 07310 | |
| Microscope | MEIJI Techno | EMZ-8TR | |
| 30 G x 11" (0.3 x 25 mm) cannula Sterican® Z | B.Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | REF: 9324500 | |
| 25 G x 11/2" (0.5 x 40 mm) cannula 100 Sterican® | B.Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | REF: 9186166 | |
| Fine pen (Stabilo point 88 fine 0.4) | Schwan-STABILO Schwanhäußer GmbH & Co. KG | Art. No: 88/36 | |
| Hot glue (Glue sticks ULTRA Power x 11 mm) | Steinel® GmbH, Herzebrock-Clarholz, Germany | Art. No: 4007841046910 | |
| Sandpaper P60 230 x 280 | Robert Bosch GmbH, Gerlingen-Schillerhöhe, Germany | Catalog Number: 2608605397 |
Referências
- Feldberg, W., Malcom, J. Experiments on the site of action of tubocurarine when applied via the cerebral ventricles. J Physiol. 149, 58-77 (1959).
- Gaddum, J. H. Push-pull cannulae. J Physiol. 155 (1 P), (1961).
- Bito, L., Davson, H., Levin, E., Murray, M., Snider, N. The concentrations of free amino acids and other electrolytes in cerebrospinal fluid, in vivo dialysate of brain, and blood plasma of the dog. J Neurochem. 13 (11), 1057-1067 (1966).
- Delgado, J. M., Lerma, J., Martín del Río, R., Solís, J. M. Dialytrode technology and local profiles of amino acids in the awake cat brain. J Neurochem. 42 (5), 1218-1228 (1984).
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