Explants rétiniens entières de poulet embryons pour Traitements électroporation et réactif chimique
Summary
Ce protocole décrit un procédé pour disséquer, expérimentalement et manipuler des explants de rétine entière de la culture d'embryons de poulet. Les cultures d'explants sont utiles lorsque le taux de réussite élevé, l'efficacité et la reproductibilité sont nécessaires pour tester les effets de plasmides pour l'électroporation et / ou des substances réactives, à savoir, les inhibiteurs enzymatiques.
Abstract
La rétine est un bon modèle pour le système nerveux central en développement. La grande taille de l'œil et surtout l'accessibilité pour les manipulations expérimentales in ovo / in vivo rend le poulet rétine embryonnaire un modèle expérimental polyvalent et très efficace. Bien que la rétine de poulet est facile à cibler in ovo par injections intra-oculaires ou l'électroporation, la concentration efficace et précise des réactifs au sein de la rétine peut être difficile de contrôler entièrement. Cela peut être dû à des variations de site d'injection exact, les fuites à partir de l'œil ou de diffusion irrégulière de ces substances. En outre, la fréquence de malformations et de mortalité après manipulations invasives telles que l'électroporation est plutôt élevé.
Ce protocole décrit un ex ovo technique pour la culture des explants de rétine entière à partir d'embryons de poulet et fournit un procédé pour contrôler l'exposition de la rétine à des réactifs. Le protocol décrit comment disséquer, expérimentalement manipuler et explants rétiniens culture entiers à partir d'embryons de poulet. Les explants peuvent être cultivées pendant environ 24 heures et être soumis à différentes manipulations telles que l'électroporation. Les principaux avantages sont que l'expérience ne dépend pas de la survie de l'embryon et que la concentration du réactif introduit on peut faire varier et contrôlé afin de déterminer et optimiser la concentration efficace. En outre, la technique est rapide, pas cher et, avec son taux de réussite expérimentale haute, il assure reproductible résultats. Il convient de souligner qu'il sert un excellent complément aux expériences réalisées in ovo.
Introduction
La rétine est une partie du système nerveux central et il est, avec sa relative simplicité et de l'architecture cellulaire bien caractérisée, un modèle populaire pour étudier le développement du système nerveux central. L'oeil de l'embryon de poulet est relativement grande en comparaison avec le reste de l'embryon. Il est donc facilement accessible in ovo à des manipulations expérimentales, telles que des injections ou l'électroporation, et sert un excellent outil pour acquérir des connaissances sur cellules rétiniennes et la biologie du développement in vivo. Malgré ces avantages majeurs, la survie des embryons peut être faible lorsque les expériences sont envahissantes comme avec électroporations, des injections répétées, ou des manipulations expérimentales combinées.
L'électroporation de plasmides d'ADN dans l'embryon de poulet in ovo est une technique importante et bien établie 1. Il permet pour l'étiquetage des neurones, le traçage du destin cellulaire ainsi que voies neuronales dans la NERV centraleous système et il permet l'expression ectopique des gènes à analyser la fonction des protéines in vivo. La technique a été utilisée pour les études de tube neural 2, Rhombencéphale 3, 4 et de la rétine. Électroporation de la rétine embryonnaire in ovo a quelques difficultés expérimentales qui sont liés à la situation in vivo. La position de l'oeil, en raison du pliage du crâne de l'embryon, est relativement proche du cœur. Cette proximité augmente le risque d'un arrêt cardiaque suivant l'électroporation, et le risque augmente avec l'âge de l'embryon. En outre, pour accéder à l'œil, il est nécessaire d'ouvrir les membranes embryonnaires, ce qui augmente le risque de saignement, des malformations et après la viabilité réduite. Lors de l'essai et l'optimisation d'un nouveau plasmide d'ADN souvent sans un résultat phénotypique connu, ces limitations peuvent diminuer l'efficacité et la puissance de la méthode, même pour un expérimentateur expérimenté. Tel que présenté dans ce protocole, la culture de la wexplant trou rétinien, définie comme la rétine neurale ensemble avec l'épithélium pigmentaire enlevée, est un procédé efficace qui complète l'approche en ovo.
Injections intraoculaires de réactifs chimiques sont relativement faciles à réaliser in ovo. Cependant, la concentration efficace et précise des réactifs injectés au sein de la rétine neurale peut être difficile de contrôler entièrement. Le volume injecté peut varier en raison de fuites et l'emplacement exact de l'injection peut affecter à la fois la distribution du réactif dans l'oeil et de la diffusion à travers le corps vitré. La variabilité aura des implications majeures pour l'interprétation des résultats lorsque ie, une courbe dose-réponse pour un inhibiteur de l'enzyme est déterminée; en particulier si l'effet est faible et la fenêtre temporelle de l'effet est étroite. En outre, un seul œil peut être utilisé à partir de chaque embryon lors de l'exécution dans des expériences in ovo en raison des effets potentiels systémiques par le biais du flux sanguinsur l'oeil controlatéral. Age appariement est important lorsque l'on étudie le développement et la variabilité individuelle entre traités et les embryons de contrôle peut conduire à la variabilité expérimentale supplémentaire.
Pour ces raisons, un procédé ex ovo basé sur des explants de rétine embryons de poulet a été développé, dans lequel la rétine neurale peut être exposé à un uniforme et contrôlée condition expérimentale in vitro. Le présent protocole a été développé sur la base de protocoles antérieurs 5-9. Explants de rétine à partir de l'étape (st) 20 (jours embryonnaires [E] 3) à ST31 (E7) d'embryons de poulet ont été disséquées, cultivées et soumises à une électroporation avec une concentration d'ADN de plasmide défini ou exposées à un milieu contenant une concentration définie d'un réactif chimique. Le protocole présenté ici a été mis en œuvre avec succès dans des publications récentes, utilisant plusieurs réactifs chimiques différents, y compris les régulateurs de la voie de dommages à l'ADN, comme KU55933, SB 218078, et NSC 109555 ditosylate, et le cycle cellulaire, tel que Cdk1 / 2 10,11 inhibiteur III.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce travail, un protocole détaillé pour la dissection, l'électroporation ou traitement chimique, et la culture des explants rétiniens entiers à partir d'embryons de poulet est présenté. Ce protocole est simple, rapide et permet à la fois un taux de réussite élevé et reproductible résultats.
L'électroporation des explants de rétine entière produit de grandes zones de cellules qui expriment le produit d'assemblage de gène d'intérêt. …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The work was supported by Barncancerfonden (PR2013-0104), Swedish Research Council (12187-18-3), ögonfonden, Kronprinsessan Margaretas arbetsnämnd för synskadade, Synfrämjandets forskningsfond and St Eriks ögonsjukhus forskningsstipendier.
Materials
| 1xPBS (tablet) | Life technologies | 18912-014 | |
| 10xDPBS | Life technologies | 14080-048 | |
| 100 mm Petri dish | VWR | 734-0006 | |
| 100 μL pipette tips | VWR | 613-0798 | |
| 1.5 mL disposable plastic cuvette | Thomas Scientific | 8495V01 | |
| 24-well plate | Sigma Aldrich | D7039 | |
| 35 mm Petri dish | VWR | 391-1998 | |
| 70% ethanol | Solveco | 1054 | |
| Cdk1/2 inhibitor III | 217714 | Calbiochem | 300nM in 0.01% DMSO |
| Cell culture incubator | Thermo Forma | ||
| Dissecting microscope | Leica | ||
| DMEM | Life Technologies | 41966-029 | |
| Electrodes | Platina, custom made | ||
| Electro square porator ECM 830 | Harvard Apparatus | ||
| F12 Nutrient mix | Life Technologies | 31331-028 | |
| FBS | Life Technologies | 16140-071 | |
| Forceps | AgnThos | 0108-5-PS | |
| Freezing medium NEG50 | Cellab, Sweden | 6502 | |
| GFP expressing DNA plasmid (pZGs) | |||
| Humidified incubator | Grumbach Brutgeraete GmbH, Asslar, Germany | 8204 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I9278-5ML | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030024 | |
| Mounting medium ProLong Gold with DAPI | Life Technologies | P36935 | |
| Paraffin film | VWR | 291-1214P | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 16005-1KG-R | |
| Peel-A-Way embedding mold | Sigma Aldrich | E6032 | |
| Penicillin streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| PhosphoHistone 3 (PH3) | Millipore | 06-570 | Dilution 1/4000 |
| Platinum electrodes (custom made from "rondelles") | Sargenta | 390-R (rondeller) | Dia: 4mm, 0.1 mm thickness |
| Platimun electrodes | Sonidel | CUY700P4L | Dia: 4 mm |
| Polyethylene pasteur pipette | VWR | 612-2853 | |
| Rotator shaker | VWR | 444-2900 | |
| Small spoon | VWR | 231-2151 | |
| Sucrose | VWR | 443815S | |
| White Leghorn eggs | Local supplier | ||
| Wine cooler | WineMaster 24, Caso, Berlin Germany |
Referências
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