Целые сетчатки Экспланты из куриных эмбрионах для обработок Электропорация и химического реагента
Summary
Этот протокол описывает метод препарировать, экспериментально манипулировать и культура целых сетчатки эксплантов из куриных эмбрионах. Эксплантата культуры полезны, когда высокий уровень успеха, эффективность и воспроизводимость необходимы, чтобы проверить эффекты плазмид для электропорации и / или реагентов веществ, т.е., ферментативных ингибиторов.
Abstract
Сетчатка является хорошей моделью для развития центральной нервной системы. Большой размер глаза и, самое главное доступность для экспериментальных манипуляций в яйце / в естественных условиях составляет куриный эмбриональный сетчатки универсальным и очень эффективным экспериментальной модели. Несмотря на то, сетчатке цыпленка легко цели в яйце по внутриглазных инъекций или электропорации, эффективное и точное концентрация реагентов в сетчатке может быть трудно полностью контролировать. Это может быть из-за вариаций точного места инъекции, утечки из глаза или неровной диффузии веществ. Кроме того, частота пороков развития и смертности после инвазивных манипуляций, таких как электропорация достаточно высока.
Этот протокол описывает экс ово техники для культивирования целые эксплантатов сетчатки из куриных эмбрионах и обеспечивает способ контролированной экспозиции сетчатки к реагентам. Протокол описывает, как препарировать, экспериментально манипулировать, и культура целых сетчатки эксплантов из куриных эмбрионах. Эксплантаты можно культивировать в течение примерно 24 ч и подвергают различным манипуляций, таких как электропорация. Основные преимущества в том, что эксперимент не зависит от выживания эмбриона и что концентрация вводимого реагента в можно варьировать и контролировать, чтобы определить и оптимизировать эффективную концентрацию. Кроме того, метод является быстрым, дешевым и вместе с его высокой скоростью успеха экспериментальной, она обеспечивает воспроизводимость Результаты. Следует особо подчеркнуть, что он служит в качестве отличным дополнением к экспериментов, проведенных в яйце.
Introduction
Сетчатка является частью центральной нервной системы, и это, с его относительной простотой и хорошо характеризуется сотовой архитектуры, популярной модели для изучения развития центральной нервной системы. Глаз эмбриона курицы является относительно большим по сравнению с остальной частью эмбриона. Поэтому легко доступны в яйце для экспериментальных манипуляций, таких как инъекции или электропорации, и служит отличным инструментом для получения знаний о клетке сетчатки и биологии развития в естественных условиях. Несмотря на эти основные преимущества, выживание эмбрионов может быть низким, когда эксперименты являются инвазивными, такие как с electroporations, повторных инъекций, или в сочетании экспериментальных манипуляций.
Электропорация плазмид ДНК в курином эмбрионе в яйце является важным и хорошо создана методика 1. Это позволяет для маркировки нейронов, отслеживание судьбы клеток, а также нервных путей в центральной NERVПодразделения системы, и это позволяет внематочной экспрессии генов для анализа функции белка в естественных условиях. Методика была использована для изучения нервной трубки 2, 3 заднего мозга, и сетчатки 4. Электропорация эмбрионального сетчатки в яйце есть некоторые экспериментальные трудности, связанные с в естественных условиях ситуации. Положение глаз, из-за черепно-мозговой складывания эмбриона, находится относительно близко к сердцу. Эта близость повышает риск сердечного приступа следующий электропорации, и риск увеличивается с возрастом эмбрионов. Кроме того, для доступа к глаз, необходимо открыть эмбриональных мембран, тем самым увеличивая риск кровотечения, пороков развития и последующего снижения жизнеспособности. При тестировании и оптимизации новой плазмиды ДНК часто без известной фенотипической исхода, эти ограничения могут снизить эффективность и силу метода даже для опытного экспериментатора. Как представлено в настоящем протоколе, культуры шдыры сетчатки эксплантов, определяется как весь нервной сетчатки с пигментным эпителием удаляется, является эффективным методом, который дополняет в ово подхода.
Интраокулярные инъекции химических реагентов относительно легко выполнить в яйце. Тем не менее, эффективное и точное содержание вводимых реагентов в нейронном сетчатки может быть трудно полностью контролировать. Вводимый объем может изменяться из-за утечки и точное место инъекции может повлиять как на распределение реагента в глаза и распространение через стекловидное тело. Изменчивость будет иметь серьезные последствия для интерпретации результатов при т.е. кривая доза-ответ для ингибитора фермента определяется; в частности, если эффект мал и временного окна эффекта является узким. Кроме того, только один глаз может быть использовано от каждого эмбриона при выполнении экспериментов в ово-за возможных системных эффектов через кровьна противоположной глаза. Возраст соответствия важно при изучении развития и индивидуальную изменчивость между лечение и контрольных эмбрионов может привести к дополнительной экспериментальной изменчивости.
По этим причинам, экс ово методом, основанным на эксплантатов сетчатки от куриных эмбрионах был разработан, в которой нейронные сетчатки могут быть подвержены равномерной и контролируемых экспериментальных условий в пробирке. Настоящий Протокол был разработан на основе предыдущих протоколов 5-9. Эксплантатов сетчатки от стадии (й) 20 (эмбриональные дней [E] 3) ST31 (Е7) куриных эмбрионов иссекали, культивируют и электропорации с определенной концентрации плазмидной ДНК или подвергается среде, содержащей определенное концентрации химического реагента. Протокол, представленные здесь была успешно реализована в последних публикациях, используя несколько различных химических реагентов, в том числе регуляторов повреждения ДНК пути, такие, как KU55933, SB 218078 и 109555 Дито НСКsylate и клеточный цикл, таких как Cdk1 / 2 ингибитора III 10,11.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой работе подробно протокол для вскрытия, электропорации или химической обработки, и культивирования целых сетчатки эксплантов из куриных эмбрионах представлена. Этот протокол является простым, быстрым и позволяет как для высокой скорости успеха и воспроизводимость Ре…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The work was supported by Barncancerfonden (PR2013-0104), Swedish Research Council (12187-18-3), ögonfonden, Kronprinsessan Margaretas arbetsnämnd för synskadade, Synfrämjandets forskningsfond and St Eriks ögonsjukhus forskningsstipendier.
Materials
| 1xPBS (tablet) | Life technologies | 18912-014 | |
| 10xDPBS | Life technologies | 14080-048 | |
| 100 mm Petri dish | VWR | 734-0006 | |
| 100 μL pipette tips | VWR | 613-0798 | |
| 1.5 mL disposable plastic cuvette | Thomas Scientific | 8495V01 | |
| 24-well plate | Sigma Aldrich | D7039 | |
| 35 mm Petri dish | VWR | 391-1998 | |
| 70% ethanol | Solveco | 1054 | |
| Cdk1/2 inhibitor III | 217714 | Calbiochem | 300nM in 0.01% DMSO |
| Cell culture incubator | Thermo Forma | ||
| Dissecting microscope | Leica | ||
| DMEM | Life Technologies | 41966-029 | |
| Electrodes | Platina, custom made | ||
| Electro square porator ECM 830 | Harvard Apparatus | ||
| F12 Nutrient mix | Life Technologies | 31331-028 | |
| FBS | Life Technologies | 16140-071 | |
| Forceps | AgnThos | 0108-5-PS | |
| Freezing medium NEG50 | Cellab, Sweden | 6502 | |
| GFP expressing DNA plasmid (pZGs) | |||
| Humidified incubator | Grumbach Brutgeraete GmbH, Asslar, Germany | 8204 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I9278-5ML | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030024 | |
| Mounting medium ProLong Gold with DAPI | Life Technologies | P36935 | |
| Paraffin film | VWR | 291-1214P | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 16005-1KG-R | |
| Peel-A-Way embedding mold | Sigma Aldrich | E6032 | |
| Penicillin streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| PhosphoHistone 3 (PH3) | Millipore | 06-570 | Dilution 1/4000 |
| Platinum electrodes (custom made from "rondelles") | Sargenta | 390-R (rondeller) | Dia: 4mm, 0.1 mm thickness |
| Platimun electrodes | Sonidel | CUY700P4L | Dia: 4 mm |
| Polyethylene pasteur pipette | VWR | 612-2853 | |
| Rotator shaker | VWR | 444-2900 | |
| Small spoon | VWR | 231-2151 | |
| Sucrose | VWR | 443815S | |
| White Leghorn eggs | Local supplier | ||
| Wine cooler | WineMaster 24, Caso, Berlin Germany |
Referências
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochem Biophys Res Commu. 230, 376-380 (1997).
- Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Method. 24, 43-48 (2001).
- Kohl, A., Hadas, Y., Klar, A., Sela-Donenfeld, D. Axonal patterns and targets of dA1 interneurons in the chick hindbrain. J Neurosc. 32, 5757-5771 (2012).
- Islam, M. M., Doh, S. T., Cai, L. In ovo electroporation in embryonic chick retina. J Vis Exp. , (2012).
- Sparrow, J. R., Hicks, D., Barnstable, C. J. Cell commitment and differentiation in explants of embryonic rat neural retina. Comparison with the developmental potential of dissociated retina. Brain res Dev brain re. 51, 69-84 (1990).
- Tomita, K., et al. Mammalian hairy and Enhancer of split homolog 1 regulates differentiation of retinal neurons and is essential for eye morphogenesis. Neuro. 16, 723-734 (1996).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc Nat Acad Sci US. 101, 16-22 (2004).
- Donovan, S. L., Dyer, M. A. Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures. Nature protocol. 1, 2710-2718 (2006).
- Thangaraj, G., Greif, A., Layer, P. G. Simple explant culture of the embryonic chicken retina with long-term preservation of photoreceptors. Exp eye re. 93, 556-564 (2011).
- Shirazi Fard, S., All-Ericsson, C., Hallbook, F. The heterogenic final cell cycle of chicken retinal Lim1 horizontal cells is not regulated by the DNA damage response pathway. Cell Cycl. 13, 408-417 (2014).
- Shirazi Fard, S., Thyselius, M., All-Ericsson, C., Hallbook, F. The terminal basal mitosis of chicken retinal Lim1 horizontal cells is not sensitive to cisplatin-induced cell cycle arrest. Cell Cycl. 13, 3698-3706 (2014).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88, 49-92 (1951).
- Gavet, O., Pines, J. Activation of cyclin B1-Cdk1 synchronizes events in the nucleus and the cytoplasm at mitosis. J Cell Bio. 189, 247-259 (2010).
- Sauer, F. Mitosis in the neural tube. J Comp Neurol. 62, 377-405 (1935).
- Baye, L. M., Link, B. A. Interkinetic nuclear migration and the selection of neurogenic cell divisions during vertebrate retinogenesis. J Neurosc. 27, 10143-10152 (2007).
