Hele Retinal eksplantater fra kylling embryoer for Electroporation og kjemisk reagens behandlinger
Summary
Denne protokollen beskriver en metode for å dissekere, eksperimentelt manipulere og kultur hele retinal eksplantater fra kylling embryoer. Eksplantatet kulturer er nyttig når høy suksessrate, effekt og reproduserbarhet er nødvendig for å teste effekten av plasmider for elektroporering og / eller reagenvolumer stoffer, dvs. enzymatiske hemmere.
Abstract
Netthinnen er en god modell for utvikling av sentralnervesystemet. Den store størrelsen på øyet og viktigst tilgjengeligheten for eksperimentelle manipulasjoner i ovo / de vivo gjør kylling embryonale netthinnen en allsidig og svært effektiv eksperimentell modell. Selv kyllingen hinnen er lett å målrette in ovo ved intraokulære injeksjoner eller elektroporering kan den effektive og nøyaktige konsentrasjon av reagenser i netthinnen være vanskelig å fullt ut kontroll. Dette kan være på grunn av variasjoner av den eksakte injeksjonsstedet, lekkasje fra øyet eller ujevn diffusjon av stoffene. Videre er hyppigheten av misdannelser og dødelighet etter invasive manipulasjoner slik som elektroporering temmelig høy.
Denne protokollen beskriver pt ex ovo teknikk for dyrking av hele retinale eksplantater fra kyllingembryoer, og tilveiebringer en fremgangsmåte for kontrollert eksponering av netthinnen til reagensene. Protocol beskriver hvordan å dissekere, eksperimentelt manipulere og kultur hele retinal eksplantater fra kylling embryoer. Explants kan dyrkes i omtrent 24 timer og bli utsatt for ulike manipulasjoner som elektroporering. De største fordeler er at eksperimentet ikke er avhengig av overlevelsen av embryoet, og at konsentrasjonen av den innførte reagens kan varieres og kontrolleres for å bestemme og optimere den effektive konsentrasjonen. Videre er rask, billig og sammen med sin høye eksperimentell suksessrate teknikken, det sikrer reproduserbar resultater. Det bør understrekes at det fungerer som et utmerket supplement til eksperimenter utført i ovo.
Introduction
Netthinnen er en del av det sentrale nervesystemet, og det er, sammen med dens relative enkelhet og veldefinert cellulær arkitektur, en populær modell for å studere sentralnervesystemet utvikling. Øyet av kylling embryo er forholdsvis stor i forhold til resten av embryoet. Det er derfor lett tilgjengelig i ovo for eksperimentelle manipulasjoner, som for eksempel injeksjoner eller elektroporering, og fungerer som et utmerket verktøy for å få kunnskap om retinal celle og utviklingsbiologi in vivo. Til tross for disse store fordeler, kan overlevelse av embryoene være lav når forsøkene er invasiv slik som med electroporations, gjentatte injeksjoner, eller kombinerte eksperimentelle manipulasjoner.
Elektroporering av DNA-plasmider inn i kyllingembryo i ovo er en viktig og veletablert teknikk 1. Det gir mulighet for merking av nevroner, sporing av cellen skjebne samt nevrale traktater i det sentrale nervOUS-systemet og det gir mulighet for ektopisk genuttrykk å analysere protein funksjon in vivo. Teknikken har vært brukt i studier av neural rør 2, bakhjerne 3, 4 og netthinnen. Electroporation av embryonale netthinnen i ovo har noen eksperimentelle problemer som er relatert til de vivo situasjon. Posisjonen til øyet, på grunn av den kraniale folding av embryoet, er relativt nær hjertet. Dette nærhet øker risikoen for hjertestans etter elektroporering, og risikoen øker med alderen på fosteret. Videre, for å få tilgang til øyet, er det nødvendig å åpne embryoniske membranene, og dermed øke risikoen for blødning, misdannelser og påfølgende redusert levedyktighet. Ved testing og optimering av en ny DNA-plasmid ofte uten kjent fenotypisk utfall, kan disse begrensninger redusere effekten og kraften av metoden, selv for en erfaren experimentalist. Som presenteres i denne protokollen, kulturen av whull retinal eksplantatet, er definert som hele nevrale netthinnen med pigment epitelet fjernet, er en effektiv metode som utfyller i ovo tilnærming.
Intraokulære injeksjoner av kjemiske reagenser er relativt enkle å utføre in ovo. Imidlertid kan den effektive og nøyaktige konsentrasjonen av injiserte reagenser i det neurale netthinnen være vanskelig å fullt ut kontrollere. Det injiserte volumet kan variere på grunn av lekkasje, og den eksakte injeksjonsstedet kan påvirke både fordelingen av reagensen i øyet og diffusjon gjennom glasslegemet. Variabiliteten vil få store konsekvenser for tolkning av resultatene når ie, er en dose-respons kurve for en enzym-inhibitor bestemmes; særlig hvis effekten er liten og den temporale vinduet av effekten er smal. Videre kan bare ett øye brukes fra hvert embryo når du utfører i ovo eksperimenter på grunn av potensielle systemiske effekter via blodetpå motsatt øye. Alder søkeord er viktig når en skal studere utvikling og individuell variasjon mellom behandlede og kontroll embryoer kan føre til ytterligere eksperimentell variabilitet.
Av disse grunner ble pt ex ovo metode basert på retinale eksplantater fra kyllingembryoer utviklet, hvor det nevrale netthinnen kan utsettes for en jevn og kontrollert eksperimentell tilstand in vitro. Den nåværende protokollen ble utviklet basert på tidligere protokoller 5-9. Retinal eksplantater fra trinn (m) 20 (embryoniske dager [E] 3) til ST31 (E7) kyllingembryoer ble dissekert, dyrket og elektroporert med en definert plasmid DNA-konsentrasjon, eller utsettes for et medium som inneholder en definert konsentrasjon av en kjemisk reagens. Protokollen som presenteres her har blitt implementert i nyere publikasjoner, ved hjelp av flere forskjellige kjemiske midler, inkludert regulatorer av DNA skade veien, for eksempel KU55933, SB 218 078, og NSC 109555 ditosylate, og cellesyklus, slik som Cdk1 / 2 inhibitor III 10,11.
Protocol
Representative Results
Discussion
I dette arbeidet et detaljert protokoll for disseksjon, elektroporering eller kjemisk behandling, og dyrking av hele retinale eksplantater fra kyllingembryoer er presentert. Denne protokollen er enkelt, raskt og gir rom for både en høy suksessrate og reproduserbar resultater.
Electroporation av hele netthinnens eksplantater produserer store deler av celler som uttrykker genkonstruksjonen av interesse. Det er lett for korrekt posisjonering av elektrodene, og for å ekspon…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The work was supported by Barncancerfonden (PR2013-0104), Swedish Research Council (12187-18-3), ögonfonden, Kronprinsessan Margaretas arbetsnämnd för synskadade, Synfrämjandets forskningsfond and St Eriks ögonsjukhus forskningsstipendier.
Materials
| 1xPBS (tablet) | Life technologies | 18912-014 | |
| 10xDPBS | Life technologies | 14080-048 | |
| 100 mm Petri dish | VWR | 734-0006 | |
| 100 μL pipette tips | VWR | 613-0798 | |
| 1.5 mL disposable plastic cuvette | Thomas Scientific | 8495V01 | |
| 24-well plate | Sigma Aldrich | D7039 | |
| 35 mm Petri dish | VWR | 391-1998 | |
| 70% ethanol | Solveco | 1054 | |
| Cdk1/2 inhibitor III | 217714 | Calbiochem | 300nM in 0.01% DMSO |
| Cell culture incubator | Thermo Forma | ||
| Dissecting microscope | Leica | ||
| DMEM | Life Technologies | 41966-029 | |
| Electrodes | Platina, custom made | ||
| Electro square porator ECM 830 | Harvard Apparatus | ||
| F12 Nutrient mix | Life Technologies | 31331-028 | |
| FBS | Life Technologies | 16140-071 | |
| Forceps | AgnThos | 0108-5-PS | |
| Freezing medium NEG50 | Cellab, Sweden | 6502 | |
| GFP expressing DNA plasmid (pZGs) | |||
| Humidified incubator | Grumbach Brutgeraete GmbH, Asslar, Germany | 8204 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I9278-5ML | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030024 | |
| Mounting medium ProLong Gold with DAPI | Life Technologies | P36935 | |
| Paraffin film | VWR | 291-1214P | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 16005-1KG-R | |
| Peel-A-Way embedding mold | Sigma Aldrich | E6032 | |
| Penicillin streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| PhosphoHistone 3 (PH3) | Millipore | 06-570 | Dilution 1/4000 |
| Platinum electrodes (custom made from "rondelles") | Sargenta | 390-R (rondeller) | Dia: 4mm, 0.1 mm thickness |
| Platimun electrodes | Sonidel | CUY700P4L | Dia: 4 mm |
| Polyethylene pasteur pipette | VWR | 612-2853 | |
| Rotator shaker | VWR | 444-2900 | |
| Small spoon | VWR | 231-2151 | |
| Sucrose | VWR | 443815S | |
| White Leghorn eggs | Local supplier | ||
| Wine cooler | WineMaster 24, Caso, Berlin Germany |
Referências
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochem Biophys Res Commu. 230, 376-380 (1997).
- Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Method. 24, 43-48 (2001).
- Kohl, A., Hadas, Y., Klar, A., Sela-Donenfeld, D. Axonal patterns and targets of dA1 interneurons in the chick hindbrain. J Neurosc. 32, 5757-5771 (2012).
- Islam, M. M., Doh, S. T., Cai, L. In ovo electroporation in embryonic chick retina. J Vis Exp. , (2012).
- Sparrow, J. R., Hicks, D., Barnstable, C. J. Cell commitment and differentiation in explants of embryonic rat neural retina. Comparison with the developmental potential of dissociated retina. Brain res Dev brain re. 51, 69-84 (1990).
- Tomita, K., et al. Mammalian hairy and Enhancer of split homolog 1 regulates differentiation of retinal neurons and is essential for eye morphogenesis. Neuro. 16, 723-734 (1996).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc Nat Acad Sci US. 101, 16-22 (2004).
- Donovan, S. L., Dyer, M. A. Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures. Nature protocol. 1, 2710-2718 (2006).
- Thangaraj, G., Greif, A., Layer, P. G. Simple explant culture of the embryonic chicken retina with long-term preservation of photoreceptors. Exp eye re. 93, 556-564 (2011).
- Shirazi Fard, S., All-Ericsson, C., Hallbook, F. The heterogenic final cell cycle of chicken retinal Lim1 horizontal cells is not regulated by the DNA damage response pathway. Cell Cycl. 13, 408-417 (2014).
- Shirazi Fard, S., Thyselius, M., All-Ericsson, C., Hallbook, F. The terminal basal mitosis of chicken retinal Lim1 horizontal cells is not sensitive to cisplatin-induced cell cycle arrest. Cell Cycl. 13, 3698-3706 (2014).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88, 49-92 (1951).
- Gavet, O., Pines, J. Activation of cyclin B1-Cdk1 synchronizes events in the nucleus and the cytoplasm at mitosis. J Cell Bio. 189, 247-259 (2010).
- Sauer, F. Mitosis in the neural tube. J Comp Neurol. 62, 377-405 (1935).
- Baye, L. M., Link, B. A. Interkinetic nuclear migration and the selection of neurogenic cell divisions during vertebrate retinogenesis. J Neurosc. 27, 10143-10152 (2007).
