Quantification du commerce intra-péritonéale Cancer de l'ovaire Métastase

Summary

Ovarian cancer metastasis is characterized by numerous diffuse intra-peritoneal lesions, such that accurate visual quantitation of tumor burden is challenging. Herein we describe a method for in situ and ex vivo quantitation of metastatic tumor burden using red fluorescent protein (RFP)-labeled tumor cells and optical imaging.

Abstract

Epithelial ovarian cancer (EOC) is the leading cause of death from gynecologic malignancy in the United States. Mortality is due to diagnosis of 75% of women with late stage disease, when metastasis is already present. EOC is characterized by diffuse and widely disseminated intra-peritoneal metastasis. Cells shed from the primary tumor anchor in the mesothelium that lines the peritoneal cavity as well as in the omentum, resulting in multi-focal metastasis, often in the presence of peritoneal ascites. Efforts in our laboratory are directed at a more detailed understanding of factors that regulate EOC metastatic success. However, quantifying metastatic tumor burden represents a significant technical challenge due to the large number, small size and broad distribution of lesions throughout the peritoneum. Herein we describe a method for analysis of EOC metastasis using cells labeled with red fluorescent protein (RFP) coupled with in vivo multispectral imaging. Following intra-peritoneal injection of RFP-labelled tumor cells, mice are imaged weekly until time of sacrifice. At this time, the peritoneal cavity is surgically exposed and organs are imaged in situ. Dissected organs are then placed on a labeled transparent template and imaged ex vivo. Removal of tissue auto-fluorescence during image processing using multispectral unmixing enables accurate quantitation of relative tumor burden. This method has utility in a variety of applications including therapeutic studies to evaluate compounds that may inhibit metastasis and thereby improve overall survival.

Introduction

Cancer de l' ovaire épithélial (COE) est la cause la plus fréquente de décès par cancer gynécologique, avec une estimation 21,290 nouveaux diagnostics aux États – Unis en 2015 et environ 14.180 décès ^1. La grande majorité (> 75%) des femmes sont diagnostiquées avec la maladie à un stade avancé (stade III ou IV) caractérisée par diffuse des métastases intra-péritonéale et de mauvais pronostic. La maladie récidive dans la cavité péritonéale après une chimiothérapie de première ligne est également courante et représente une cause majeure de mortalité ^2,3. COU métastase par un mécanisme unique impliquant à la fois dans le prolongement direct de la tumeur primaire vers les organes péritonéaux voisins ainsi que par la dissociation ou l'excrétion des cellules de la surface de la tumeur primaire en tant que cellules individuelles ou des agrégats multicellulaires. Les cellules sont éliminées dans la cavité péritonéale, dans laquelle ils résistent l' apoptose induite par le ^{détachement-4.} Accumulation de l'ascite péritonéale est commun, comme les cellules tumorales hangar bloquent le drainage lymphatique péritonéale et tumors produisent des facteurs de croissance qui modifient la perméabilité vasculaire. Une partie des cellules tumorales hangar fixer à la surface des organes péritonéale et structures , y compris l' intestin, le foie, l' épiploon et le mésentère, après quoi ils ancrent et prolifèrent pour produire de multiples lésions secondaires largement diffusées ^3,5. métastase hématogène est rare. Ainsi, la gestion clinique consiste habituellement en chirurgie cytoreductive y compris "debulking optimale", définie comme la résection de la tumeur tout visible (peu importe la taille). Cytoréduction complète est associée à une augmentation significative de la survie globale ^6,7 et est associée au défi de l' identification et l' élimination des lésions <0,5 cm.

petits modèles animaux ont démontré l'utilité dans la recherche de cancer de l'ovaire dans l'amélioration de notre compréhension de la progression de la maladie aussi bien dans l'identification de biomarqueurs et de tests de nouvelles chimiothérapies ou des approches de thérapie combinaison de pronostic. Comme le primairele site de l'incidence du cancer de l'ovaire et de la métastase est la cavité péritonéale, les modèles orthotopique de EOC métastases implique l'analyse et la caractérisation des maladies intrapéritonéale. Bien qu'il y ait eu des améliorations récentes dans la capacité de cellules tumorales d'image, même au niveau de la cellule unique, il existe encore des difficultés importantes dans la quantification de la charge de la tumeur métastatique du COU. Ces défis se posent en raison du nombre, la taille et la localisation anatomique des lésions métastatiques. En outre, il existe un besoin de cellules cancéreuses d'étiquettes pour les distinguer des cellules normales de l'hôte. Des études antérieures ont utilisé des protocoles ou la transfection de cellules tumorales avec la luciférase ^8,9 marquage à base d' anticorps. Marquage fluorescent direct des cellules cancéreuses a été d' abord rapportée par Chishima et ses collaborateurs en 1997 ^10. Des marqueurs fluorescents ne nécessitent pas l' addition d' un substrat exogène et fournissent une spécificité exquise des cellules tumorales, en fournissant un moyen plus efficace pour suivre les métastases du cancer ^11,12 </sup>.

Nous décrivons ici un procédé d'imagerie optique destiné à l' analyse quantitative de la maladie métastatique au moyen d' un modèle de xénogreffe orthotopique syngénique constitué de la protéine fluorescente rouge (RFP) -tagged cellules murines de cancer de l' ovaire ID8 ¹³ et des souris C57 / BL6 immunocompétentes. Nous démontrons une nouvelle méthode de rapport de la charge tumorale en combinant la quantification in vivo et l' imagerie ex vivo par prélèvement de tissu auto-fluorescence. Cette approche a une utilité potentielle dans des études visant à évaluer l'effet de facteurs génétiques, épigénétiques ou micro-environnement spécifique des modifications et / ou des modalités de traitement des métastases spécifique d'un organe de cancer de l'ovaire.

Protocol

Toutes les études in vivo ont été approuvées par l'Université de Notre Dame de protection des animaux et l' utilisation Comité et ont utilisé des souris C57 / BL6J féminins. 1. murin cancer de l'ovaire Culture cellulaire Rendre le milieu de l'ovaire de souris ID8 de cellules de cancer de la culture comme suit: 1 L de milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) additionné de 4% de sérum bovin fœtal (FBS), 1% de pénicilline / streptomycine, 5 pg…

Representative Results

Le mécanisme métastatique du cancer des ovaires est caractérisé par des métastases hautement diffuse intrapéritonéal constitué de nombreuses lésions de diverses tailles, y compris de multiples petits (<2 mm) des lésions. Ainsi, l' utilisation de cellules tumorales marquées DP (figure 1) et l' imagerie optique fournit une méthode alternative pour le comptage manuel et la mesure de la taille des lésions. Le développement de la charge tumorale au fi…

Discussion

Contrairement aux études utilisant des cellules cancéreuses d'ovaire humain qui doivent être menées dans des souris immunodéprimées, le protocole décrit ci-dessus utilise des souris immunocompétentes C57 / BL6 et des cellules syngéniques de souris de cancer de l'ovaire. Bien que cette évaluation du rôle potentiel des infiltrats immunitaires dans la progression tumorale et les métastases permet, la présence de cheveux noirs sur la surface abdominale rend l'imagerie moins sensible. Utilisation d&#…

Materials

Dulbecco's Modified Eagle Medium	Corning	10-014-CM
Fetal bovine serum	Gibco	10437-028
penicillin/streptomycin
Insulin-transferrin-sodium selenite media supplement	Sigma	I-1884
Bruker Xtreme small animal imaging system	Bruker Corp.
Bruker Multispectral software	Bruker Corp
lentiviral particles with Red fluorescent protein	GenTarget, Inc.	LVP023
trypsin for cell culture	Corning	25-053-CI
PBS	Corning	21-040-CM
depilatory cream (such as Nair Hair Remover Lotion)	purchases from drugstore	n/a
ImageJ software	http://imagej.nih.gov/ij/		free download
dissecting tools (forceps)	Roboz Surgical Instrument	RS 5130
dissecting tools (Scissors)	Roboz Surgical Instrument	RS 5910