La cuantificación de la intra-peritoneal del cáncer ovárico Metástasis
Summary
Ovarian cancer metastasis is characterized by numerous diffuse intra-peritoneal lesions, such that accurate visual quantitation of tumor burden is challenging. Herein we describe a method for in situ and ex vivo quantitation of metastatic tumor burden using red fluorescent protein (RFP)-labeled tumor cells and optical imaging.
Abstract
Epithelial ovarian cancer (EOC) is the leading cause of death from gynecologic malignancy in the United States. Mortality is due to diagnosis of 75% of women with late stage disease, when metastasis is already present. EOC is characterized by diffuse and widely disseminated intra-peritoneal metastasis. Cells shed from the primary tumor anchor in the mesothelium that lines the peritoneal cavity as well as in the omentum, resulting in multi-focal metastasis, often in the presence of peritoneal ascites. Efforts in our laboratory are directed at a more detailed understanding of factors that regulate EOC metastatic success. However, quantifying metastatic tumor burden represents a significant technical challenge due to the large number, small size and broad distribution of lesions throughout the peritoneum. Herein we describe a method for analysis of EOC metastasis using cells labeled with red fluorescent protein (RFP) coupled with in vivo multispectral imaging. Following intra-peritoneal injection of RFP-labelled tumor cells, mice are imaged weekly until time of sacrifice. At this time, the peritoneal cavity is surgically exposed and organs are imaged in situ. Dissected organs are then placed on a labeled transparent template and imaged ex vivo. Removal of tissue auto-fluorescence during image processing using multispectral unmixing enables accurate quantitation of relative tumor burden. This method has utility in a variety of applications including therapeutic studies to evaluate compounds that may inhibit metastasis and thereby improve overall survival.
Introduction
Cáncer de ovario epitelial (EOC) es la causa más común de muerte por neoplasia ginecológica, con un estimado de 21.290 nuevos diagnósticos en los EE.UU. en 2015 y un estimado de 14.180 muertes 1. La gran mayoría (> 75%) de las mujeres son diagnosticadas con enfermedad en etapa tardía (estadio III o IV) caracteriza por metástasis difusa intra-peritoneal y mal pronóstico. Recurrencia de la enfermedad en la cavidad peritoneal después de la quimioterapia de primera línea también es común y representa una causa importante de mortalidad 2,3. EOC metástasis por un mecanismo único que implica tanto la extensión directa del tumor primario a los órganos peritoneales vecinos, así como por la disociación o desprendimiento de las células de la superficie del tumor primario como células individuales o agregados multicelulares. Las células se desprenden en la cavidad peritoneal, en el que se resisten a la apoptosis inducida por el desprendimiento-4. La acumulación de ascitis peritoneal es común, como las células tumorales arrojar bloquean el drenaje linfático peritoneal y tumors producen factores de crecimiento que alteran la permeabilidad vascular. Una parte de las células tumorales cobertizo se adhieren a la superficie de los órganos peritoneales y estructuras, incluyendo el intestino, el hígado, epiplón y mesenterio, después de lo cual se anclan y proliferan para producir múltiples lesiones secundarias ampliamente difundidos 3,5. metástasis hematógena es infrecuente. Por lo tanto, el manejo clínico consiste comúnmente de la cirugía citorreductora incluyendo "citorreducción óptima", definida como la resección de todo el tumor visible (no importa cuán pequeño). Citorreducción completa se asocia con un aumento significativo en la supervivencia global 6,7 y se asocia con el reto de la identificación y eliminación de las lesiones <0,5 cm.
los pequeños modelos animales han demostrado utilidad en la investigación del cáncer de ovario en la mejora de nuestra comprensión de la evolución de la enfermedad, así como en la identificación de biomarcadores pronósticos y ensayo de nuevas quimioterapias o aproximaciones de la terapia de combinación. A medida que la primariasitio de la incidencia de cáncer de ovario y de la metástasis es la cavidad peritoneal, modelos ortotópico de EOC metástasis implica el análisis y caracterización de la enfermedad intraperitoneal. Aunque ha habido recientes mejoras en la capacidad de las células tumorales de imagen, incluso a nivel de células individuales, aún existen dificultades significativas en la cuantificación de la carga tumoral metastásica del COE. Estos retos surgen debido a la cantidad, el tamaño y la localización anatómica de las lesiones metastásicas. Además existe una necesidad de células de cáncer de etiqueta para distinguirlas de las células huésped normales. Estudios anteriores han utilizado protocolos de etiquetado a base de anticuerpos o transfección de células tumorales con 8,9 luciferasa. El marcaje fluorescente directa de las células cancerosas se informó por primera vez por Chishima y compañeros de trabajo en 1997 10. Los marcadores fluorescentes no requieren la adición de sustrato exógeno y proporcionan exquisita especificidad de las células tumorales, proporcionando un medio más eficaz para rastrear la metástasis del cáncer 11,12 </sup>.
Aquí se describe un método de formación de imágenes ópticas para el análisis cuantitativo de la enfermedad metastásica utilizando un modelo de xenoinjerto ortotópico singénico compuesto por proteína fluorescente roja (RFP)-etiquetados murino ID8 células de cáncer de ovario 13 y C57 / BL6 ratones inmunocompetentes. Se demuestra un nuevo método de cuantificación relativa de la carga tumoral combinando in vivo y ex vivo de formación de imágenes con la eliminación de tejido auto-fluorescencia. Este enfoque tiene utilidad potencial en estudios diseñados para evaluar el efecto de específico genética, epigenéticos o micro-ambientales modificaciones y / o modalidades de tratamiento en la metástasis de órganos específicos de cáncer de ovario.
Protocol
Representative Results
Discussion
En contraste con los estudios que utilizan las células de cáncer de ovario humanos que deben ser realizados en ratones inmunodeficientes, el protocolo descrito anteriormente utiliza los ratones inmunocompetentes C57 / Bl6 y las células de cáncer de ovario murinos singénicos. Si bien esto permite la evaluación de la posible función de los infiltrados inmunes en la progresión tumoral y la metástasis, la presencia de pelo oscuro en la superficie abdominal hace menos sensible de formación de imágenes. El uso de u…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by research grants RO1CA109545 and RO1CA086984 to M.S.S. by the National Institutes of Health/National Cancer Institute and by an award from the Leo and Ann Albert Charitable Trust (to M.S.S.).
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Corning | 10-014-CM | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10437-028 | |
| penicillin/streptomycin | |||
| Insulin-transferrin-sodium selenite media supplement | Sigma | I-1884 | |
| Bruker Xtreme small animal imaging system | Bruker Corp. | ||
| Bruker Multispectral software | Bruker Corp | ||
| lentiviral particles with Red fluorescent protein | GenTarget, Inc. | LVP023 | |
| trypsin for cell culture | Corning | 25-053-CI | |
| PBS | Corning | 21-040-CM | |
| depilatory cream (such as Nair Hair Remover Lotion) | purchases from drugstore | n/a | |
| ImageJ software | http://imagej.nih.gov/ij/ | free download | |
| dissecting tools (forceps) | Roboz Surgical Instrument | RS 5130 | |
| dissecting tools (Scissors) | Roboz Surgical Instrument | RS 5910 |
Referências
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