La quantificazione di intra-peritoneale del cancro ovarico metastasi

Summary

Ovarian cancer metastasis is characterized by numerous diffuse intra-peritoneal lesions, such that accurate visual quantitation of tumor burden is challenging. Herein we describe a method for in situ and ex vivo quantitation of metastatic tumor burden using red fluorescent protein (RFP)-labeled tumor cells and optical imaging.

Abstract

Epithelial ovarian cancer (EOC) is the leading cause of death from gynecologic malignancy in the United States. Mortality is due to diagnosis of 75% of women with late stage disease, when metastasis is already present. EOC is characterized by diffuse and widely disseminated intra-peritoneal metastasis. Cells shed from the primary tumor anchor in the mesothelium that lines the peritoneal cavity as well as in the omentum, resulting in multi-focal metastasis, often in the presence of peritoneal ascites. Efforts in our laboratory are directed at a more detailed understanding of factors that regulate EOC metastatic success. However, quantifying metastatic tumor burden represents a significant technical challenge due to the large number, small size and broad distribution of lesions throughout the peritoneum. Herein we describe a method for analysis of EOC metastasis using cells labeled with red fluorescent protein (RFP) coupled with in vivo multispectral imaging. Following intra-peritoneal injection of RFP-labelled tumor cells, mice are imaged weekly until time of sacrifice. At this time, the peritoneal cavity is surgically exposed and organs are imaged in situ. Dissected organs are then placed on a labeled transparent template and imaged ex vivo. Removal of tissue auto-fluorescence during image processing using multispectral unmixing enables accurate quantitation of relative tumor burden. This method has utility in a variety of applications including therapeutic studies to evaluate compounds that may inhibit metastasis and thereby improve overall survival.

Introduction

Cancro ovarico epiteliale (EOC) è la più comune causa di morte per neoplasia ginecologica, con una stima di 21,290 nuove diagnosi negli Stati Uniti nel 2015 e si stima che 14.180 decessi ^1. La stragrande maggioranza (> 75%) delle donne con diagnosi di malattia in stadio avanzato (stadio III o IV) caratterizzata da diffuse metastasi intra-peritoneale e prognosi infausta. Recidiva di malattia nella cavità peritoneale dopo chemioterapia di prima linea è comune e rappresenta una delle principali cause di mortalità ^2,3. EOC metastatizza da un unico meccanismo che coinvolge sia diretta estensione dal tumore primario agli organi peritoneali vicini così come per dissociazione o spargimento di cellule dalla superficie del tumore primario come singole cellule o aggregati multicellulari. Le cellule sono capannone nella cavità peritoneale, in cui resistono distacco indotta l'apoptosi ^4. Accumulo di ascite peritoneale è comune, come le cellule tumorali capannone bloccare il drenaggio linfatico peritoneale e tumors producono fattori di crescita che alterano la permeabilità vascolare. Una porzione di cellule tumorali capannone attaccare alla superficie degli organi peritoneali e strutture compreso intestino, fegato, omento e mesentere, dopo di che ancorano e proliferano per produrre più lesioni secondarie ampiamente diffusi ^3,5. metastasi ematogena è raro. Così, gestione clinica comunemente è costituito da chirurgia citoriduttiva tra cui "debulking ottimale", definita come la resezione di tutto tumore visibile (non importa quanto piccolo). Citoriduzione completa è associato ad un significativo aumento della sopravvivenza totale ^6,7 ed è associato con la sfida di identificazione e la rimozione delle lesioni <0,5 cm.

modelli piccoli animali hanno dimostrato l'utilità nella ricerca sul cancro ovarico nel migliorare la nostra comprensione della progressione della malattia, nonché l'identificazione di biomarcatori prognostici e la sperimentazione di nuovi chemioterapie o approcci di terapia di combinazione. Come il primariosito di incidenza del cancro ovarico e metastasi è la cavità peritoneale, modelli ortotopici di EOC metastasi coinvolgono l'analisi e la caratterizzazione della malattia intraperitoneale. Anche se ci sono stati i recenti miglioramenti nella capacità di cellule tumorali immagine, anche a livello di singola cellula, esistono ancora notevoli difficoltà nel quantificare il carico tumorale metastatico del EOC. Queste sfide si presentano a causa del numero, le dimensioni e la localizzazione anatomica delle lesioni metastatiche. Inoltre esiste una necessità di cellule tumorali etichetta per distinguerli dai normali cellule ospiti. Studi precedenti hanno utilizzato protocolli di etichettatura a base di anticorpi o trasfezione di cellule tumorali con luciferasi ^8,9. Etichettatura diretta fluorescente delle cellule tumorali è stato segnalato da Chishima e collaboratori nel 1997 ^10. Etichette fluorescenti non richiedono aggiunta di substrato esogeno e di offrire una piacevole specificità delle cellule tumorali, fornendo un mezzo più efficace per tenere traccia delle metastasi del cancro ^11,12 </sup>.

Qui si descrive un metodo di imaging ottico per l'analisi quantitativa della malattia metastatica utilizzando un modello di xenotrapianto ortotopico singenici composta da proteina fluorescente rossa (RFP) -tagged murine ID8 cellule di cancro ovarico ¹³ e topi C57 / BL6 immuno-competenti. Abbiamo dimostrato un nuovo metodo di relativa carico tumorale quantificazione combinando in vivo ed ex vivo l'imaging con rimozione del tessuto auto-fluorescenza. Questo approccio ha potenziale utilità in studi volti a valutare l'effetto di specifici genetica, epigenetica o microambientali modifiche e / o modalità di trattamento sulla metastasi organo-specifiche di cancro ovarico.

Protocol

Tutti gli studi in vivo sono stati approvati dalla University of Notre Dame cura degli animali e del Comitato uso e utilizzati femminili topi C57 / BL6J. 1. murino Ovarian Cancer Cell Culture Rendere il murino terreno di coltura delle cellule del cancro ovarico ID8 come segue: 1 L di Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) integrato con 4% siero fetale bovino (FBS), 1% penicillina / streptomicina, 5 mg / Insulina ml, 5 mg / ml transferrina e 5 ng / ml di sodio selenite. </l…

Representative Results

Il meccanismo metastatico del cancro ovarico è caratterizzato da altamente diffusa metastasi intraperitoneale composto da numerose lesioni di varie dimensioni, tra cui più di piccole dimensioni (<2 mm) lesioni. Pertanto, l'uso di cellule tumorali RFP marcato (Figura 1) e l'imaging ottico fornisce un metodo alternativo per conteggio manuale e la misurazione delle dimensioni della lesione. Lo sviluppo della massa tumorale nel tempo può essere determinata sett…

Discussion

In contrasto con gli studi utilizzando cellule di cancro ovarico umano che devono essere condotti in topi immunocompromessi, il protocollo sopra descritto utilizza topi immunocompetenti C57 / BL6 e le cellule di cancro ovarico murini singenici. Mentre questo consente di valutare il ruolo potenziale di infiltrati immunitari in progressione tumorale e metastasi, la presenza di peli scuri sulla superficie addominale rende meno sensibili di imaging. Uso di un depilatoria per rimuovere i capelli prima di imaging migliora l&#…

Materials

Dulbecco's Modified Eagle Medium	Corning	10-014-CM
Fetal bovine serum	Gibco	10437-028
penicillin/streptomycin
Insulin-transferrin-sodium selenite media supplement	Sigma	I-1884
Bruker Xtreme small animal imaging system	Bruker Corp.
Bruker Multispectral software	Bruker Corp
lentiviral particles with Red fluorescent protein	GenTarget, Inc.	LVP023
trypsin for cell culture	Corning	25-053-CI
PBS	Corning	21-040-CM
depilatory cream (such as Nair Hair Remover Lotion)	purchases from drugstore	n/a
ImageJ software	http://imagej.nih.gov/ij/		free download
dissecting tools (forceps)	Roboz Surgical Instrument	RS 5130
dissecting tools (Scissors)	Roboz Surgical Instrument	RS 5910