Die Quantifizierung von Intraperitonealtest Ovarian Cancer Metastasis

Summary

Ovarian cancer metastasis is characterized by numerous diffuse intra-peritoneal lesions, such that accurate visual quantitation of tumor burden is challenging. Herein we describe a method for in situ and ex vivo quantitation of metastatic tumor burden using red fluorescent protein (RFP)-labeled tumor cells and optical imaging.

Abstract

Epithelial ovarian cancer (EOC) is the leading cause of death from gynecologic malignancy in the United States. Mortality is due to diagnosis of 75% of women with late stage disease, when metastasis is already present. EOC is characterized by diffuse and widely disseminated intra-peritoneal metastasis. Cells shed from the primary tumor anchor in the mesothelium that lines the peritoneal cavity as well as in the omentum, resulting in multi-focal metastasis, often in the presence of peritoneal ascites. Efforts in our laboratory are directed at a more detailed understanding of factors that regulate EOC metastatic success. However, quantifying metastatic tumor burden represents a significant technical challenge due to the large number, small size and broad distribution of lesions throughout the peritoneum. Herein we describe a method for analysis of EOC metastasis using cells labeled with red fluorescent protein (RFP) coupled with in vivo multispectral imaging. Following intra-peritoneal injection of RFP-labelled tumor cells, mice are imaged weekly until time of sacrifice. At this time, the peritoneal cavity is surgically exposed and organs are imaged in situ. Dissected organs are then placed on a labeled transparent template and imaged ex vivo. Removal of tissue auto-fluorescence during image processing using multispectral unmixing enables accurate quantitation of relative tumor burden. This method has utility in a variety of applications including therapeutic studies to evaluate compounds that may inhibit metastasis and thereby improve overall survival.

Introduction

Epithelialen Ovarialkarzinom (EOC) ist die häufigste Todesursache von gynäkologischen Krebserkrankung, mit einem geschätzten 21.290 Neuerkrankungen in den USA im Jahr 2015 und schätzungsweise 14.180 Todesfälle ^1. Die überwiegende Mehrheit (> 75%) der Frauen mit Spätstadium der Krankheit diagnostiziert (Stadium III oder IV) durch diffuse Intraperitonealtest Metastasierung und schlechter Prognose charakterisiert. Wiederauftreten der Krankheit in der Bauchhöhle folgenden First-Line – Chemotherapie ist auch üblich , und stellt eine der Hauptursachen für die Sterblichkeit ^2,3. EOC metastasiert durch einen einzigartigen Mechanismus sowohl direkte Verlängerung aus dem Primärtumor zu benachbarten Peritonealdialyse Organe sowie durch die Dissoziation oder vergießen von Zellen aus der primären Tumoroberfläche als einzelne Zellen oder mehrzelligen Aggregate beteiligt sind. Die Zellen werden in die Bauchhöhle Schuppen, wobei sie Ablösung induzierte Apoptose ⁴ widerstehen. Anhaftungen von Peritonealdialyse Aszites ist weit verbreitet, wie Schuppen Tumorzellen Peritonealdialyse Lymphdrainage und t blockierenumors produzieren Wachstumsfaktoren, die die vaskuläre Permeabilität zu verändern. Ein Teil der Schuppen Tumorzellen heften sich an die Oberfläche von Peritoneal Organe und Strukturen , einschließlich Darm, Leber, Omentum und Mesenterium, woraufhin sie mehrere weit verbreitet Sekundärläsionen ^3,5 herzustellen verankern und sich vermehren. Hämatogener Metastasierung ist selten. So klinische Management besteht üblicherweise aus onkologischer Chirurgie einschließlich "optimalen debulking", definiert als Resektion aller sichtbaren Tumors (egal wie klein). Komplette Zytoreduktion ist mit einem deutlichen Anstieg der Gesamtüberlebenszeit ^6,7 zugeordnet und mit der Herausforderung der Identifizierung und Beseitigung von Läsionen <0,5 cm verbunden.

als auch bei der Identifizierung von prognostischer Biomarker und Erprobung neuer Chemotherapien oder Kombinationstherapie Ansätze Kleintiermodellen haben Nutzen bei Ovarialkarzinom Forschung bewiesen in unserem Verständnis der Krankheitsprogression zu verbessern. Als primäreWebsite von Eierstockkrebsinzidenz und Metastasierung ist die Bauchhöhle, orthotopen Modelle von EOC Metastasierung die Analyse und Charakterisierung von intraperitoneale Krankheit betreffen. Obwohl es in der Fähigkeit, Bildtumorzellen jüngsten Verbesserungen gewesen, auch auf Einzelzellebene, gibt es immer noch erhebliche Schwierigkeiten in der metastasierten Tumorbelastung von EOC zu quantifizieren. Diese Herausforderungen entstehen durch die Anzahl, Größe und anatomische Lage der Metastasen. Weiterhin besteht ein Bedarf nach Etikettenkrebszellen, um sie von normalen Wirtszellen zu unterscheiden. Frühere Studien haben Antikörper-basierten Markierungsprotokolle oder Transfektion von Tumorzellen mit Luciferase ^8,9 verwendet. Direkte Fluoreszenzmarkierung von Krebszellen wurde erstmals 1997 von ¹⁰ Chishima und Mitarbeitern berichtet. Fluoreszierende Markierungen erfordern keine Zugabe von exogenem Substrat und liefern vorzügliches Tumorzellspezifität, bieten ein wirksameres Mittel Krebsmetastase ^11,12 verfolgen </sup>.

Wir beschreiben hier eine optische Bildgebungsverfahren für die quantitative Analyse von Metastasen eine syngene orthotoper Xenograftmodell von rot fluoreszierendes Protein (RFP) umfasste mit -markierte murine ID8 Ovarkrebszellen ¹³ und immunkompetenten C57 / BL6 – Mäusen. Wir zeigen , ein neues Verfahren der relativen Quantifizierung der Tumorlast in vivo Vereinigen und ex vivo – Bildgebung mit Entfernung von Gewebe Autofluoreszenz. Dieser Ansatz hat einen potentiellen Nutzen in Studien entwickelt, um die Wirkung von spezifischen genetischen, epigenetischen oder Mikroumweltänderungen und / oder Behandlungsmethoden für organspezifische Metastasierung des Ovarialkarzinoms zu bewerten.

Protocol

Alle in – vivo – Studien wurden von der University of Notre Dame Animal Care und Use Committee und verwendet weiblichen C57 / BL6J Mäuse zugelassen. 1. Murine Ovarian Cancer Cell Culture Machen das ID8 murine Eierstockkrebszellkulturmedium wie folgt: 1 L von Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM), supplementiert mit 4% fötalem Rinderserum (FBS), 1% Penicillin / Streptomycin, 5 ug / ml Insulin, 5 ug / ml Transferrin und 5 ng / ml Natriumselenit. U…

Representative Results

Der metastasierendem Mechanismus des Ovarialkarzinoms durch hochdiffusem Intraperitonealtest Metastasierung gekennzeichnet, bestehend aus zahlreichen Läsionen unterschiedlicher Größe, darunter mehrere kleine (<2 mm) Läsionen. Somit ist die Verwendung von RFP-markierten Tumorzellen (Abbildung 1) und optische Bildgebung stellt eine alternative Methode zur manuellen Zählung und Messung der Größe der Läsion. Die Entwicklung von Tumorbelastung im Laufe der Zeit kan…

Discussion

Im Gegensatz zu Studien mit menschlichen Eierstockkrebszellen verwendet, die bei immunsupprimierten Mäusen durchgeführt werden müssen, beschrieben das Protokoll nutzt oben immunokompetente C57 / BL6-Mäusen und syngenen Maus Eierstockkrebszellen. Während diese Einschätzung der möglichen Rolle von Immun Infiltrate in der Tumorprogression und Metastasierung ermöglicht, macht das Vorhandensein von dunklen Haaren auf der Bauchoberfläche Bildgebung weniger empfindlich. Verwendung eines Haarentfernungs Haare vor der B…

Materials

Dulbecco's Modified Eagle Medium	Corning	10-014-CM
Fetal bovine serum	Gibco	10437-028
penicillin/streptomycin
Insulin-transferrin-sodium selenite media supplement	Sigma	I-1884
Bruker Xtreme small animal imaging system	Bruker Corp.
Bruker Multispectral software	Bruker Corp
lentiviral particles with Red fluorescent protein	GenTarget, Inc.	LVP023
trypsin for cell culture	Corning	25-053-CI
PBS	Corning	21-040-CM
depilatory cream (such as Nair Hair Remover Lotion)	purchases from drugstore	n/a
ImageJ software	http://imagej.nih.gov/ij/		free download
dissecting tools (forceps)	Roboz Surgical Instrument	RS 5130
dissecting tools (Scissors)	Roboz Surgical Instrument	RS 5910