سهلة ودقيقة والميكانيكية التنميط على Micropost صالحة
Summary
Described are protocols for quantifying mechanical interactions between adherent cells and microstructured substrates. These interactions are closely linked to essential cell behaviors including migration, proliferation, differentiation, and apoptosis. The protocols present an open-source image analysis software called MechProfiler, which enables determination of involved forces for each micropost.
Abstract
Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate surroundings. Particularly, cell-substrate interactions are the main interest. Today micropost arrays are a well-characterized and established method with a broad range of applications that have been published over the last decade. However, there seems to be a reservation among biologists to adapt the technique due to the lengthy and challenging process of micropost manufacture along with the lack of easily approachable software for analyzing images of cells interacting with microposts.
The force read-out from microposts is surprisingly easy. A micropost acts like a spring with the cell ideally attached at its tip. Depending on size a cell applies force from its cytoskeleton through one or multiple focal adhesion points to the micropost, thus deflecting the micropost. The amount of deflection correlates directly to the applied force in direction and in magnitude. The number of microposts covered by a cell and the post deflection patterns are characteristic and allow determination of values like force per post and many biologically relevant parameters that allow “mechano-profiling” of cell phenotypes.
A convenient method for mechano-profiling is described here combining the first generation of ready-to-use commercially available microposts with an in-house developed software package that is now accessible to all researchers. As a demonstration of typical application, single images of bone cancer cells were taken in bright-field microscopy for mechano-profiling of cell line models of metastasis. This combination of commercial traction force sensors and open source software for analysis allows for the first time a rapid implementation of the micropost array technique into routine lab work done by non-expert users. Furthermore, a robust and streamlined analysis process enables a user to analyze a large number of micropost images in a highly time-efficient manner.
Introduction
المقايسات خلية مقرها الحساسة والميكانيكية تسمح للتحقيق في الخلايا الملتصقة، مع مجموعة واسعة من التطبيقات التي تعكس الدور المحوري الذي يمكن أن تلعبه الميكانيكا في بيولوجيا الخلية. هذه التطبيقات غالبا ما تركز على الآليات الأساسية التي تقود عمليات التحت خلوية أو السلوك خلية كاملة. من جهة، يمكن أن العوامل البيئية الخارجية مثل اضافية تكوين مصفوفة الخلوية أو مصفوفة الصلابة تؤثر بشكل كبير على الاستجابة الميكانيكية والبيولوجية للخلية. 1 والشيء نفسه يمكن ملاحظتها بعد استخدام فئات كثيرة من المركبات النشطة صيدليا، وآثار والتي هي غالبا ما تتميز باستخدام نماذج ثقافة الخلية. 2 وفي غيرها من الخصائص الوراثية اليد، مثل تلك التي تسببها طفرات جينية عفوية أو تجريبيا يسببها، ويمكن أن تحدث تغيرات ملحوظة في النمط الظاهري الخلية التي ترتبط مع التغيرات في بنية الهيكل الخلوي وظيفة. 3 هذه الأمثلة ل فقط عدد قليل من كثير ممكنالموضوعات التي phenotyping الميكانيكي للخلايا هو ذات الصلة، وجرى التحقيق مع كل هذه مفيدة مع المصفوفات micropost.
وفي وقت كتابة هذا التقرير، تم نشر ما يقرب من 200 المقالات التي تصف التفاعل خلية micropost. هذه الأعمال مناقشة الجوانب النظرية للمبادئ انحراف micropost وكذلك الإرشادات العملية على صنعها. تم نشر المقالة الأولى التي تصف التفاعل بين الخلايا والمصفوفات micropost مرنة تان وزملاؤه في عام 2003. 4 وعلى النقيض من الكلاسيكية المجهري قوة الجر (TFM) حيث تستخدم ركائز لينة مستمرة لتقدير انقباض الخلايا nanonewton النطاق، تان وآخرون. وصف طريقة استخدام عدة عوارض رأسية متباعدة عن كثب مصنوعة من السيليكون والمطاط الصناعي. المزايا الرئيسية لهذه التقنية الخروج من اثنين من السمات الرئيسية. أولا من أجل تغيير خلايا واضحة الركيزة صلابة واحد يحتاج فقط إلى تغيير أبعاد micropost مع الحفاظتكوين الركيزة خلاف مستمر وبالتالي تجنب الاختلافات في طوبولوجيا السطحية والكيمياء. microposts الثانية تتصرف مثل الينابيع الفردية التي يمكن تحليلها بتحفظ مع قوة ودقة مكانية بناء على أمر من الالتصاقات البؤرية الفردية ويمكن أن تقلل من التحديات التحليلية التي هي ملازمة لتحليل مماثل من قبل ستاندرد TFM.
اليوم مجموعة من التطبيقات للصفائف micropost يتجاوز بكثير مجرد رسم الخرائط من القوات لبضع خلايا مفردة. على سبيل المثال، أكياما تقارير استخدام من الأنسجة سفينة ظهري معزولة عن يرقة العث بمثابة المحرك للمجموعة micropost، من أجل وضع الحشرات التي تعمل بالطاقة العضلية مستقلة الصغرى الروبوت. 5
ومع ذلك، فقد ركزت معظم التطبيقات المنشورة microposts على دراسات الحالات الطبية مثل العدوى أو السرطان. على سبيل المثال، تم استخدام المصفوفات micropost لدراسة توليد قوة المجمعة النوع الرابع الشعرة لبكتيريا gonorrhالمستعمرات أويا مقترن شلالات إشارة المعززة للعدوى. وقد استخدمت 6 آخرون microposts لدراسة خلايا سرطان الثدي تعامل مع المركبات الدوائية استهداف الهيكل الخلوي. 7
غالبا ما يوصف انحراف لmicropost باستخدام نظرية الكلاسيكية شعاع لناتئ مع نهاية الحمل على افتراض الخلية تعلق فقط على الحافة جدا من micropost. هنا F القوة المطبقة التي تسبب δ انحراف يعتمد على micropost في "الانحناء صلابة" ك ويحسب عن طريق:
(1)
مع E، I، وL يجري معامل يونغ، لحظة مجال الجمود وشعاع طول التوالي. ومع ذلك، النتائج من هذه المعادلة تعطي سوى تقريب العام للقوات في العمل منذ شعاع القص والثني وكذلك لا تؤخذ تزييفها الركيزة في ميلانالعد. وبالنظر إلى أن microposts تكون عادة مصنوعة من مواد لينة مثل polydimethylsiloxane (PDMS) المستندة مطاط السيليكون تحتاج هذه العوامل التي ينبغي إدراجها. . شوين آخرون أثبتت أن هناك مثل هذا عامل التصحيح بناء على نسبة العرض إلى الارتفاع micropost (L / D) والبوليمر المقابلة للنسبة بواسون ضد 8 وتعطى من قبل:
(2)
مع الميل T (ت) أن يكون معامل إمالة يتضمن كما يمكن العثور عليها في المادة نفسها المناسب المعلمة = 1.3:
(3)
وهذا يعني صلابة وmicropost لتصحيح ك المراسل هو نتاج خالص الانحناء صلابة ك = ك الانحناء ومعامل التصحيح نيوسقدمها:
(4)
لذلك، يجب أن يتم تنفيذ العمليات الحسابية قوة الخلية باستخدام الاختلاف أكثر دقة من المعادلة (1) القراءة الآن:
(5)
تأثير التصحيح يصبح أكثر وضوحا في أقرب وقت يتم استخدام القيم النموذجية لأبعاد micropost. على سبيل المثال، micropost 15 ميكرون طويل مع المقطع العرضي دائري وقطره 5 ميكرومتر المصنوعة من المطاط سيليكون القائمة على PDMS-يؤدي إلى معامل التصحيح 0.77 وبالتالي على حساب غير المصححة أن المبالغة قوات خلية المبذولة بنسبة 23٪. هذا يصبح أكثر حدة لmicroposts مع نسب أصغر.
تقليديا، كما تم على أساس micropost تحليل الصورة على شعاع المثالي نظرية الانحناء. في عام 2005 المجموعة التي كانت رائدة في استخدام ميكرصفائف opost نشرت برمجيات تحليل صورة مناسبة لتحليل micropost 9 البرنامج يتطلب ترخيص البرمجيات ويجب على المستخدم أن تأخذ ثلاث صور لكل موقف؛ واحد من كل من أعلى وأسفل طائرات micropost في اسطة نقل واحدة أخرى في وضع مضان مع الخلية الملون. بعد مقارنة المناصب العليا والسفلي لكل micropost البرنامج يحدد حقل القوة ناقلات ويحسب المعلمات ذات الصلة مثل قوة لكل وظيفة. وجود حزم البرامج الأخرى وذكرت المبادئ تحليلهم لفترة وجيزة في المواد ذات الصلة التي تصف لهم، ولكن هذه حزم البرامج التحليلية هي عموما ليست متاحة للجمهور. 10،11
ويمكن تصنيف صفائف micropost مصممة للقوات خلية رسم الخرائط إما يجري في تخطيط micropost متعامد أو أحد سداسية، وهذه الأخيرة التي لديها ميزة الثغرات مسافة واحدة بين جميع microposts الجار. microposts نموذجية هكتارلقد مقطع عرضي دائري وأبعادها تتراوح من 1.0 ميكرون إلى 10 ميكرون في القطر و2-50 ميكرون في الطول. 4 ومع ذلك، كما تم الإبلاغ عن microposts مع المقطع العرضي بيضاوي الشكل أو مربع. 12،13
استخدام مخاليط سيليكون استنادا PDMS-كمادة micropost يسمح لإضافة النانوية إلى الخليط. على سبيل المثال إضافة الكوبالت النانو قضبان تمكن التنشيط المغناطيسي للmicropost وبالتالي يعطي آخر درجة من الحرية للتصاميم تجريبية المحتملة. 14 معظم الجماعات تنتج صفائف micropost على ركائز صلبة مسطحة مثل غطاء زجاجي أو داخل طبق بتري. ومع ذلك، ذكرت مان وزملاء العمل مؤخرا مجموعة micropost شكلت على غشاء لمط 15 يسمح هذا التطبيق من خلية القوات تمتد إلى الخلايا الملتصقة أثناء دراسته يعيش خلايا التحت خلوية الردود ديناميكية من حيث انقباض الخلايا.
العاملين على نطاق واسع، ومعظم إنشوتستند عملية أسسنا لجعل صفائف micropost على الطباعة الحجرية الناعمة كما هو موضح في البروتوكولات الثاقبة من Sniadecki والزملاء. 16-18 في عمليات غرف الأبحاث قياسية قصيرة وتستخدم لتوليد المجهرية على رأس رقاقة السيليكون باستخدام مقاومة للضوء SU8. ويلي ذلك عملية النسخ حيث يلقي المطاط سيليكون على هياكل نقلها إلى قوالب. في الخطوة الثانية وتستخدم هذه القوالب لتكرار المجهرية الأولية باستخدام المطاط سيليكون على رأس الركيزة المختار. ولكن على الرغم من العدد الكبير والمتزايد من المنشورات المتعلقة تطبيقها، وإنشاء عملية التصنيع لmicroposts يأخذ قدرا كبيرا من الوقت حتى لخبراء الهندسة الدقيقة. هناك العديد من الخطوات العملية التي تتطلب التحسين والتكيف مع بيئة معملية محددة وتخطيط micropost أن يؤديا إلى مستوى جودة مقبول.
صفائف micropost التجارية متوفرة الآن في استعداد رس استخدام ("خارج على الرف") تنسيق مع جودة عالية على الدوام. على هذا النحو فهي بديل لعملية التصنيع المعقدة والطويلة اللازمة لإنتاج في الموقع. في هذه الورقة تم استخدام مجموعة micropost المتاحة تجاريا لرسم خرائط القوات الخلوية باستخدام مشرق الميدان صورة واحدة المجهري. الأهم توضح هذه المادة ويوثق تماما وظيفية برمجيات المصدر المفتوح اسمه MechProfiler، والذي يتوفر للتحميل كمادة تكميلية لهذه المخطوطة. نسخة الحفاظ بنشاط من البرنامج يمكن أيضا الاطلاع على http://www.orthobiomech.ethz.ch.
مزيج من "حاضرة" فحص وتحليل البرمجيات مفتوحة المصدر متوافق يخفض بشكل ملحوظ العقبة دخول إلى تحقيق تجارب TFM دقيقة. يمكن للباحثين من دون الوصول إلى أي مرافق غرفة نظيفة أو الخبرة لتطوير البرمجيات تحليل قوات الخلوية بنجاح. انها تمكن المستخدم من التركيز على mechanosensitivity الناتج الفحص بدلا من التكنولوجيا في حد ذاتها، ويجعل قياسات قوة الجر المتاحة للمجتمع الأوسع. وعلاوة على ذلك، وهذا هو خطوة هامة لتمهيد الطريق نحو الفحص التلقائي بالكامل من صفائف micropost.
برامج التحليل MechProfiler بمعالجة الصور في ملف تنسيق TIFF، PNG، BMP و JPG. يمكن أن تؤخذ الصور باستخدام مضان، الطوري أو مشرق الميدان المجهر الضوئي. تشغيل برنامج مستقل مع حرية ماتلاب مترجم وقت التشغيل (متوفر على العنوان التالي: الشكل 12) والخوارزميات الكامنة تسمح لمعالجة الصور مبسط، والتي تمكن المستخدم من معالجة الصور مع الخلايا وحيدة أو متعددة في حوالي 1 دقيقة. وعلاوة على ذلك، وهذه الخلايا قد تكون إما يعيشون أو "ثابتة".
برنامج MechProfiler قادر على زيادة كبيرة في تحليل البيانات الإنتاجية من خلال الاعتماد على استنساخ صفائف micropost التجاري الجودة، وبشكل أكثر تحديدا، الافتراضي & #8220؛ غير نحيد "موقف كل وظيفة في مجموعة يمكن افتراض ضد شبكة مثالية (الانحرافات التصنيع للحصول على الشبكة في صفائف المستخدمة في هذه الدراسة كانت أقل من 100 نانومتر).
في واحد قصير يفتح مجموعة مختارة من ملفات الصور لتحليل والمحاصيل منهم إلى المنطقة من الفائدة، ويحدد المشاركات التي كتبها مغطاة بخلايا أو التي تحتاج إلى التخلص منها، ويحدد المواقف آخر، وحساب الانحرافات / القوات ضد الشبكة المثالية، وأخيرا يوفر جميع البيانات خلية محددة مع وجود إمكانية للتصدير، بما في ذلك جدول المكتبية العادية.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويسعى هذا العمل للمضي قدما في مجال قوة الجر المجهري عن طريق خفض كبير الحواجز التقنية والعملية للدخول. هذه الحواجز تأتي من الجانبين. أولا وقبل كل شيء هي العديد من التحديات التقنية غير تافهة التي يجب التغلب عليها لتصنيع بتكاثر وتكليف مجموعة micropost تجريبيا. الثاني، هو ال?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Committee Technology and Innovation (CTI) Switzerland grant 14796-PFLS-LSCTI. MicroPost arrays were generously provided by MicroDuits GmbH.
Materials
| T25 cell culture flasks | Nunc | 156367 | |
| 1x PBS-buffer | Sigma | D8537 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400054 | |
| Medium DMEM/F12 | Sigma | D8437 | |
| FBS South America | Life Technologies | 10270106 | |
| Penicillin-Streptomycin 100x | Sigma | P4333 | |
| 15 ml centrifuge vials | Sarstedt | 62.554.502 | |
| Micropost array | MicroDuits | MPA-col1/FN | Micropost dimensions: |
| pre-coated with Collagen I/Fibronectin | Ø= 6.4 µm, l=18.2 µm; grid= 13 µm, kcorr= 2.87 nN/µm | ||
| Ethanol abs p.A. | Merck | 100.983 | |
| 12-well plate | Nunc | 150628 | |
| Formalin solution, neutral buffered 10% | Sigma | HT5011 | |
| Brilliant Blue G-250 | Sigma | 27815 | Coomassie blue |
| Methanol ACS p.A. | Merck | 1.06009 | |
| Acetic acid | Sigma | 695092 | |
| Glass bottom dish | WillCo Wells BV | GWSb-3522 | 35 mm diameter, aperture 22 mm |
| T-100 Eclipse | Nikon | n/a | Inverted microscope |
| D3-L3 | Nikon | n/a | Camera controler |
| DS Fi2 | Nikon | Camera |
Referências
- Sharma, R. I., Snedeker, J. G. Biochemical and biomechanical gradients for directed bone marrow stromal cell differentiation toward tendon and bone. Biomaterials. 31 (30), 7695-7704 (2010).
- Suresh, S. Biomechanics and biophysics of cancer cells. Acta Biomater. 3 (4), 413-438 (2007).
- Bartalena, G., et al. A novel method for assessing adherent single-cell stiffness in tension: design and testing of a substrate-based live cell functional imaging device. Biomed Microdevices. 13 (2), 291-301 (2011).
- Tan, J. L., et al. Cells lying on a bed of microneedles: An approach to isolate mechanical force. PNAS. 100 (4), 1484-1489 (2003).
- Akiyama, Y., Hoshino, T., Iwabuchi, K., Morishima, K. Room Temperature Operable Autonomously Moving Bio-Microrobot Powered by Insect Dorsal Vessel Tissue. PloS ONE. 7 (7), (2012).
- Biais, N., Ladoux, B., Higashi, D., So, M., Sheetz, M. Cooperative retraction of bundled type IV pili enables nanonewton force generation. Plos Biology. 6 (4), 907-913 (2008).
- Wuang, S. C., Ladoux, B., Lim, C. T. Probing the Chemo-Mechanical Effects of an Anti-Cancer Drug Emodin on Breast Cancer Cells. Cell Mol Bioeng. 4 (3), 466-475 (2011).
- Schoen, I., Hu, W., Klotzsch, E., Vogel, V. Probing Cellular Traction Forces by Micropillar Arrays: Contribution of Substrate Warping to Pillar Deflection. Nano Lett. 10 (5), 1823-1830 (2010).
- Lemmon, C. A., et al. Shear Force at the Cell-Matrix Interface: Enhanced Analysis for Microfabricated Post Array Detectors. Mech Chem Biosyst. 2 (1), 1-16 (2005).
- Lam, R. H. W., Weng, S. N., Lu, W., Fu, J. P. Live-cell subcellular measurement of cell stiffness using a microengineered stretchable micropost array membrane. Integr Biol-UK. 4 (10), 1289-1298 (2012).
- Roure, O., et al. Force mapping in epithelial cell migration. PNAS. 102 (39), 14122-14122 (2005).
- Papenburg, B. J., Rodrigues, E. D., Wessling, M., Stamatialis, D. Insights into the role of material surface topography and wettability on cell-material interactions. Soft Matter. 6 (18), 4377-4388 (2010).
- Badique, F., et al. Directing nuclear deformation on micropillared surfaces by substrate geometry and cytoskeleton organization. Biomaterials. 34 (12), 2991-3001 (2013).
- Sniadecki, N. J., et al. Magnetic microposts as an approach to apply forces to living cells. PNAS. 104 (37), 14553-14558 (2007).
- Weng, R. H. W. A silicone-based stretchable micropost array membrane for monitoring live-cell subcellular cytoskeletal response. Lab Chip. 12, 731-740 (2012).
- Desai, R. A., Yang, M. T., Sniadecki, N. J., Legant, W. R., Chen, C. S. Microfabricated Post-Array-Detectors (mPADs): an Approach to Isolate Mechanical Forces. J Vis Exp. (8), e311 (2007).
- Yang, M. T., Fu, J. P., Wang, Y. K., Desai, R. A., Chen, C. S. Assaying stem cell mechanobiology on microfabricated elastomeric substrates with geometrically modulated rigidity. Nat Protoc. 6 (2), 187-213 (2011).
- Sniadecki, N. J., Han, S. J., Ting, L. H., Feghhi, S. Micropatterning in Cell Biology. Methods in Cell Biol. 121, 61-73 (2014).
