Легкая и точная механотерапии профилирование на Micropost массивов

Summary

Described are protocols for quantifying mechanical interactions between adherent cells and microstructured substrates. These interactions are closely linked to essential cell behaviors including migration, proliferation, differentiation, and apoptosis. The protocols present an open-source image analysis software called MechProfiler, which enables determination of involved forces for each micropost.

Abstract

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate surroundings. Particularly, cell-substrate interactions are the main interest. Today micropost arrays are a well-characterized and established method with a broad range of applications that have been published over the last decade. However, there seems to be a reservation among biologists to adapt the technique due to the lengthy and challenging process of micropost manufacture along with the lack of easily approachable software for analyzing images of cells interacting with microposts.

The force read-out from microposts is surprisingly easy. A micropost acts like a spring with the cell ideally attached at its tip. Depending on size a cell applies force from its cytoskeleton through one or multiple focal adhesion points to the micropost, thus deflecting the micropost. The amount of deflection correlates directly to the applied force in direction and in magnitude. The number of microposts covered by a cell and the post deflection patterns are characteristic and allow determination of values like force per post and many biologically relevant parameters that allow “mechano-profiling” of cell phenotypes.

A convenient method for mechano-profiling is described here combining the first generation of ready-to-use commercially available microposts with an in-house developed software package that is now accessible to all researchers. As a demonstration of typical application, single images of bone cancer cells were taken in bright-field microscopy for mechano-profiling of cell line models of metastasis. This combination of commercial traction force sensors and open source software for analysis allows for the first time a rapid implementation of the micropost array technique into routine lab work done by non-expert users. Furthermore, a robust and streamlined analysis process enables a user to analyze a large number of micropost images in a highly time-efficient manner.

Introduction

Механотерапии чувствительные основе клеток анализы позволяют расследование прилипшие клетки, с широким спектром применения, которые отражают центральную роль, которую может играть механика в клеточной биологии. Эти приложения часто сосредоточиться на основных механизмов, которые управляют субклеточные процессы или поведение цельноклеточную. С одной стороны, внешние факторы окружающей среды, такие как дополнительное состава матрикса или матрицы жесткости может существенно влиять на механические и биологические реакции в клетке. ¹ То же самое можно было наблюдать после использования многих классов фармацевтически активных соединений, воздействие которых являются часто характеризуется использованием модели клеточной культуры. ² С другой стороны, генотипических свойств, таких как те, которые вызваны спонтанным или экспериментально индуцированных генетических мутаций, могут вызвать заметные изменения в клеточной фенотипа, которые связаны с изменениями в структуре цитоскелета и функции. ³ Эти примеры лишь немногие из многих возможныхТемы, по которым механические фенотипирование клеток является актуальной, и все из них были с пользой разбираться с micropost массивов.

На момент написания этой статьи, примерно 200 статей были опубликованы описания клеток micropost взаимодействия. Эти работы обсуждаются теоретические аспекты micropost принципов отклонения, а также практические инструкции по их производству. Первая статья, описывающая взаимодействие клеток и гибких массивов micropost была опубликована Тан и его коллеги в 2003 году ⁴ В отличие от классической тяги силовой микроскопии (TFM), где непрерывные мягкие субстраты, используемой для оценки сократительной клеток nanonewton масштабе, Тан и др. описан способ с использованием нескольких близко расположенных вертикальных балок из силиконового эластомера. Основные преимущества этого метода возникают из двух основных функций. Во-первых, с тем, чтобы изменить жесткость подложки клеток-очевидно нужно только изменить размеры, сохраняя micropostкомпозиция в противном случае постоянной и, таким образом, избежать различия в топологии и химии поверхности подложки. Второй microposts действовать как отдельные источники, которые могут быть дискретно анализируемых с силой и пространственным разрешением порядка отдельных координационных спаек и может уменьшить аналитические проблемы, которые присущи с аналогичным анализа по стандарту МТФ.

На сегодняшний день ассортимент приложений для micropost массивов значительно превышает только отображение сил в течение нескольких одиночных клеток. Например, Акияма сообщает об использовании изолированной Спинной сосуд ткани от моли гусеницы в качестве привода для массива micropost, для того, чтобы разработать мышцы насекомых питанием автономный микро-робота. ⁵

Тем не менее, большинство опубликованных приложения microposts сосредоточились на изучении медицинских условиях, таких как инфекции или рака. Например, micropost массивы были использованы для изучения поколения силовое комплекте типа IV пили Neisseria gonorrhОЕА колонии, который связан с сигналом каскадов повышения инфекции. ⁶ Другие используемые microposts изучать клетки рака молочной железы, получавших фармацевтических соединений, направленных цитоскелета. ⁷

Прогиб micropost часто описывается с помощью классической теории света для консоли с конечным нагрузки, предполагая ячейку придает только самый кончик micropost. Здесь приложенная сила F, что вызывает отклонение б зависит от "жесткости" изгиба к этой micropost и вычисляется по формуле:

(1)

с Е, I, L и будучи модуля Юнга, момент инерции площадей и длина пучка соответственно. Тем не менее, результаты этого уравнения дают лишь общее приближение сил на работе, так как балки стрижки и изгиб, а также подложки деформации не учитываются переменного токарассчитывать. Учитывая, что microposts как правило, сделаны из мягких материалов, таких как полидиметилсилоксановой (PDMS) основе силиконового каучука эти факторы должны быть включены. . Шон и др показали, что существует такой фактор коррекции на основе соотношения сторон micropost (L / D) и соответствующие полимера коэффициент Пуассона ^V 8 Оно дается.:

(2)

С Т _{наклона} (v) является коэффициент наклона, что включает в себя подходящий параметр а = 1,3, как можно найти в той же статье:

(3)

Это означает, что жесткость исправлена ​​micropost в K _корр является продуктом чистого изгибной жесткости к = к _изгибу и поправочный коэффициент корропределяется по формуле:

(4)

Таким образом, расчеты клеток сила должна быть выполнена с использованием более совершенной изменение уравнения (1) сейчас читаете:

(5)

Влияние коррекции становится более очевидным, как только типичные значения для размеров micropost используются. Например, 15-микронный пор micropost с круглым поперечным сечением и диаметром 5 мкм из ПДМС основе силиконового каучука приводит к поправочный коэффициент 0,77 и, следовательно, без поправки расчет будет переоценить оказываемое клеток силы на 23%. Это становится еще более тяжелой для microposts с меньшими пропорциями.

Традиционно, micropost анализа изображений также были основаны на идеализированной пучка теории изгиба. В 2005 году группа, которая является пионером в использовании MICROPOST массивы опубликовал программное обеспечение для анализа изображений подходит для анализа micropost ⁹ программное обеспечение требует лицензии на программное обеспечение, а пользователь должен принять три изображения для каждой позиции. по одному из верхних и нижних плоскостей micropost в режиме передачи в и другой в режиме флуоресценции с окрашенных ячейки. После сравнения верхние и нижние позиции для каждого micropost программное обеспечение определяет вектор силы поля и вычисляет соответствующие параметры, как сила на должность. Другие пакеты программного обеспечения существуют и их принципы анализа кратко упоминается в соответствующих статьях, описывающих их, но эти аналитические программные пакеты, как правило, не является общедоступной. ^10,11

Массивы micropost, предназначенные для отображения ячеек сил может быть классифицированы как будучи в ортогональной планировки micropost или гексагональную, последний из которых имеют то преимущество, равноудаленных зазоры между соседними всех microposts. Типичные microposts гаве круглое поперечное сечение и их размеры в диапазоне от 1,0 до 10 мкм в диаметре и от 2 до 50 мкм в длину. ⁴ Однако microposts с эллиптической или квадратным поперечным сечением также сообщалось. ^12,13

Использование силиконовых смесей ПДМС основе как micropost материала позволяет добавлять наночастиц в смеси. Например добавки кобальта нано-стержней обеспечивает магнитную активацию micropost и таким образом дает еще степень свободы для потенциальных экспериментальных образцов. ¹⁴ Большинство групп произвести их массивы micropost на плоских жестких материалах, таких как стекло или крышка внутри чашки Петри. Тем не менее, Манн и его коллеги недавно сообщили массив micropost сформированный на раст мембраны. ¹⁵ Это позволяет приложению клеточных растягивающих сил в адгезивных клеток при изучении живых клеток внутриклеточное динамические характеристики с точки зрения клеточной сократимости.

Широко используются и наиболее Estabчания способ получения micropost массивов на основе мягкой литографии, как описано в глубокие протоколов Sniadecki и коллег. ^16-18 коротких стандартных процессов в чистых помещениях используются для создания микроструктур на вершине кремниевой пластины с использованием SU8 фоторезиста. Это сопровождается копировального процесса, в котором силиконовый каучук отливают над структуры передачи их в формы. На втором этапе эти формы используются для репликации исходной микроструктуры с использованием силиконового каучука на вершине выбранного субстрата. Однако, несмотря на большой и растущего числа публикаций, связанных с их применением, устанавливающих производственный процесс для microposts занимает значительное количество времени, даже для микро-инженерных специалистов; Есть много шагов процесса, которые требуют оптимизации и адаптации к конкретной тестовой среде и макет micropost с получением приемлемого уровня качества.

Коммерческие массивы micropost теперь доступны в готовом-то-использование ("вне-шельф") формат с неизменно высоким качеством. Как таковые, они являются альтернативой сложной и длительной производственного процесса, необходимого для производства на месте. В этой статье коммерчески доступный массив micropost был использован для отображения клеточные силы с помощью одного ярко-микроскопии изображение. Что еще более важно эта статья описывает и документирует полностью функциональное программное обеспечение с открытым исходным кодом под названием MechProfiler, которая доступна для скачивания в виде дополнительного материала к этой рукописи. Активно поддерживается версия программного обеспечения также можно найти на http://www.orthobiomech.ethz.ch.

Сочетание "вне-шельф" анализа и совместимым программным обеспечением для анализа с открытым исходным кодом заметно снижает барьер входа для достижения точных экспериментов TFM. Исследователи не имеют доступа к либо чистых помещений или опыт разработки программного обеспечения может анализировать клеточные силы успешно. Это позволяет пользователю сосредоточиться на mechanosensitivity анализ выход, а не сама технология, и делает измерения силы тяги, доступные для более широкого сообщества. Кроме того, это важный шаг, чтобы проложить путь к полностью автоматической скрининга micropost массивов.

Программное обеспечение MechProfiler анализ процессов изображения в формате TIFF-файл, PNG, BMP и JPG. Изображения могут быть приняты с использованием флуоресценции, фазового контраста или яркие поля световой микроскопии. Автономная программа работает вместе с бесплатным Matlab Compiler Runtime (доступной по адресу: Рисунок 12) и основные алгоритмы позволяет упорядочить обработку изображений, что позволяет пользователю обрабатывать изображения с одной или нескольких ячеек в 1 мин. Кроме того, эти клетки могут быть либо жить или "фиксированной".

Программное обеспечение MechProfiler способен значительно повысить пропускную способность анализа данных, опираясь на воспроизводимость качества коммерческой micropost массивов, более конкретно, по умолчанию & #8220; без отклоняется "положение каждой должности в массиве можно предположить с идеальной сетки (производственные отклонения для сетки в массивах, используемых в данном исследовании были меньше, чем 100 нм).

В короткой открывает выбор файлов изображений для анализа, культуры их интересующей области, определяет сообщения, покрытые клетками, или которые должны быть отброшены, определяет пост позиции, вычисляет отклонения / силы против идеальной сетки, и, наконец, сохраняет все данные клеточные конкретных, с возможностью для экспорта, в том числе в стандартном офисном таблицы.

Protocol

1. культивирования клеток на Micropost массивов Примечание: Все шаги должны быть выполнены в кабинете биологической безопасности, чтобы обеспечить стерильность. Объемы приведенные здесь для культивирования клеток Т25 колб. Культуры клеток среднего рецепт и посева клеток пло?…

Representative Results

Основным преимуществом описанной методике заключается в его простоте и потенциал для быстрого и эффективного интеграции в повседневную лабораторных работ. Сочетание высокого качества коммерческих массивов датчиков в паре с программным обеспечением с открытым исходным кодом предос…

Discussion

Эта работа направлена ​​на продвижение поле тяги силовой микроскопии существенно снижая технические и практические барьеры для входа на рынок. Эти барьеры приходят с двух сторон. Прежде всего это многочисленные нетривиальные технические проблемы, которые необходимо преодолеть, что…

Materials

T25 cell culture flasks	Nunc	156367
1x PBS-buffer	Sigma	D8537
0.5% Trypsin-EDTA	Life Technologies	15400054
Medium DMEM/F12	Sigma	D8437
FBS South America	Life Technologies	10270106
Penicillin-Streptomycin 100x	Sigma	P4333
15 ml centrifuge vials	Sarstedt	62.554.502
Micropost array	MicroDuits	MPA-col1/FN	Micropost dimensions:
pre-coated with Collagen I/Fibronectin			Ø= 6.4 µm, l=18.2 µm; grid= 13 µm, kcorr= 2.87 nN/µm
Ethanol abs p.A.	Merck	100.983
12-well plate	Nunc	150628
Formalin solution, neutral buffered 10%	Sigma	HT5011
Brilliant Blue G-250	Sigma	27815	Coomassie blue
Methanol ACS p.A.	Merck	1.06009
Acetic acid	Sigma	695092
Glass bottom dish	WillCo Wells BV	GWSb-3522	35 mm diameter, aperture 22 mm
T-100 Eclipse	Nikon	n/a	Inverted microscope
D3-L3	Nikon	n/a	Camera controler
DS Fi2	Nikon		Camera