Stamcelachtige<em> Xenopus</em> Embryonale Explantaten om te studeren Early Neural Developmental Kenmerken<em> In Vitro</em> En<em> In Vivo</em
Summary
In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.
Abstract
Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.
Introduction
Het gewervelde zenuwstelsel Uit de neurale plaat als een homogene laag van neuro-epitheelcellen. Begrijpen hoe ontwikkelingsprogramma's worden geïnduceerd, gecodeerd, en vastgesteld tijdens regionalisering van de neurale plaat is, op dit moment, een belangrijke doelstelling in de ontwikkelingsbiologie. In vergelijking met andere systemen, de experimenteel vatbaar Xenopus embryo is een model van keuze voor het analyseren van vroege stappen van neurale ontwikkeling 1,2. Het is gemakkelijk om grote aantallen embryo's te verkrijgen en buitenlandse ontwikkeling geeft toegang tot de eerste stappen van neurulatie 3. Veel tools beschikbaar om experimenteel te manipuleren Xenopus laevis (X. laevis) embryonale ontwikkeling. Micro-injectie van mRNA of morfolino (MO), waaronder induceerbare MO, samen met biochemische en farmacologische gereedschappen, maakt gecontroleerde gain of function (GOF) en functieverlies (LOF) en de specifieke wijziging van signaaltransductiewegen 4,5. De blastocoel dak ectoderm, rond de animale pool van een blastula of een zeer vroeg gastrula embryo en aangeduid als het "Animal Cap (AC), een bron van pluripotente cellen die kunnen worden geprogrammeerd door manipulatie van genexpressie vóór explantaten bereiding. In dit manuscript zijn gedetailleerde protocollen te gebruiken X. laevis AC explantaten testen in vitro pt in vivo moleculaire mechanismen en cellulaire mechanismen van neurale ontwikkeling.
Een techniek wordt gepresenteerd, waardoor fijne observatie van genexpressie patronen in een Xenopus kikkervisje neurale buis, een eerste stap in de identificatie van het lot bepalen cues. Overwegende dat de waarneming van de flat-gemonteerde weefsels vaak wordt gebruikt in de studie van kippenembryo's 6, het is niet goed beschreven in Xenopus. Manipulatie van genexpressie door het injecteren van synthetisch mRNA of MO in de blastomeren van 2 of 4 cellig stadium embryo maakt programmering van ACexplantaten 4. Bijvoorbeeld remming van Bone Morphogenetic Protein (BMP) route door expressie van het anti-BMP factor Noggin, geeft een neuraal identiteit AC cellen 3. Het protocol wordt gedetailleerd beschreven voor het uitvoeren van lokale en tijd gecontroleerde blootstelling van AC explantaten om extrinsieke signalen via direct contact met een anionenuitwisselingshars kraal. Tenslotte wordt een techniek beschreven voor het testen ontwikkelings kenmerken van neurale voorlopercellen in vivo transplantatie van gemengde explantaten bereid uit verschillende geprogrammeerde cellen gedissocieerd en opnieuw verbonden.
De kikker embryo is een krachtig model voor de vroege gewervelde neurale ontwikkeling te bestuderen. Het combineren van manipulatie van genexpressie in vitro culturen explanteren levert belangrijke informatie bij de studie van neuroepithelium regionalisering, proliferatie en morfogenese 7-12. De programmering van AC explantaten toegelaten ontwikkeling van een functionele hart ex vivo 13,14. Het gebruikvan explantaat enten 15 geleid tot de identificatie van de minimale transcriptionele switch induceren van de neurale differentiatie programma 16. De zona limitans intrathalamica (ZLI) is een signalering centrum dat sonic hedgehog (Shh) om de groei en regionalisering van de caudale voorhersenen controle afscheidt. Bij voortdurende blootstelling aan Shh, neuro-cellen co-expressie van de drie transcriptiefactor genen – Barh-achtige homeobox-2 (barhl2), orthodenticle-2 (otx2) pt Iroquois-3 (irx3) – verwerven van twee kenmerken van de ZLI compartiment: de bevoegdheid om uitdrukken shh, en de mogelijkheid om te scheiden van de voorste neurale plaat cellen. Als modelsysteem, zal de inductie van een ZLI lot in neuro-epitheelcellen gepresenteerd 8.
Deze protocollen zijn gericht op het leveren van eenvoudige, goedkope en efficiënte hulpmiddelen voor ontwikkelingsstoornissen biologen en andere onderzoekers om de fundamentele mec verkennenhanisms van belangrijke neurale cel gedrag. Deze protocollen zijn zeer veelzijdig en laat het onderzoek van een groot aantal extrinsieke en intrinsieke neurale vastberadenheid cues. Het staat op lange termijn in vivo analyse van de neurale lineage inzet, inductieve interacties en cel gedrag.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neurale ontwikkeling georkestreerd door een complex samenspel van cellulaire ontwikkelingsprogramma's en signalen van de omringende weefsels (besproken in 3,31,32). Hier beschrijven we een set protocollen die gebruikt kunnen worden in X. laevis embryo's extrinsieke en intrinsieke factoren betrokken bij neurale lot bepalen en neurale morfogenese in vitro pt in vivo onderzoeken. Deze protocollen kunnen worden gebruikt als zodanig op X. tropicalis embryo echter X. …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The author thanks Hugo Juraver-Geslin, Marion Wassef and Anne Hélène Monsoro-Burq for their help and advice, and the Animal Facility of the Institut Curie. The author thanks Paul Johnson for his editing work on the manuscript. This work was supported by the Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS UMR8197, INSERM U1024) and by grants from the “Association pour la Recherche sur le Cancer” (ARC 4972 and ARC 5115; FRC DOC20120605233 and LABEX Memolife) and the Fondation Pierre Gilles de Gennes (FPGG0039).
Materials
| Paraformaldehyde | VWR | 20909.290 | Toxic |
| anion exchange resin beads | Biorad | 140- 1231 | |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A-7888 | For culture of animal cappH 7.6 |
| Gentamycine | GIBCO | 15751-045 | antibiotic |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A7906 | for bead preparation |
Referências
- Nieuwkoop, P. D. IIB, Pattern formation in the developing central nervous system (CNS) of the amphibians and birds (English). Proceedings of the Koninklijke Nederlandse Akademie van Wetenschappen. 94, 121-127 (1991).
- Nieuwkoop, P. D. The neural induction process; its morphogenetic aspects. Int J Dev Biol. 43, 615-623 (1999).
- Harland, R. Neural induction. Curr Opin Genet Dev. 10, 357-362 (2000).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early development of Xenopus laevis : a laboratory manual. , (2000).
- Hoppler, S., Vize, P. D., Hoppler, S., Vize, P. D. . Xenopus protocols : post-genomic approaches. , (2012).
- Franklin Hughes, W., La Velle, A. The effects of early tectal lesions on development in the retinal gonglion cell layer of chick embryos. J Comp Neurol. 163, 265-283 (1975).
- Theveneau, E., Mayor, R. Beads on the run: beads as alternative tools for chemotaxis assays. Methods Mol Biol. 769, 449-460 (2011).
- Juraver-Geslin, H. A., Gomez-Skarmeta, J. L., Durand, B. C. The conserved barH-like homeobox-2 gene barhl2 acts downstream of orthodentricle-2 and together with iroquois-3 in establishment of the caudal forebrain signaling center induced by Sonic Hedgehog. Dev Biol. 396, 107-120 (2014).
- Green, J. B., New, H. V., Smith, J. C. Responses of embryonic Xenopus cells to activin and FGF are separated by multiple dose thresholds and correspond to distinct axes of the mesoderm. Cell. 71, 731-739 (1992).
- Wallingford, J. B., Ewald, A. J., Harland, R. M., Fraser, S. E. Calcium signaling during convergent extension in Xenopus. Curr Biol. 11, 652-661 (2001).
- Kiecker, C., Niehrs, C. A morphogen gradient of Wnt/beta-catenin signalling regulates anteroposterior neural patterning in Xenopus. DEVELOPMENT. 128, 4189-4201 (2001).
- Wilson, P. A., Hemmati-Brivanlou, A. Induction of epidermis and inhibition of neural fate by Bmp-4. Nature. 376, 331-333 (1995).
- Afouda, B. A., Hoppler, S. Xenopus explants as an experimental model system for studying heart development. Trends in cardiovascular medicine. 19, 220-226 (2009).
- Afouda, B. A. Stem-cell-like embryonic explants to study cardiac development. Methods Mol Biol. 917, 515-523 (2012).
- Milet, C., Monsoro-Burq, A. H. Dissection of Xenopus laevis neural crest for in vitro explant culture or in vivo transplantation. Journal of visualized experiments: JoVE. , (2014).
- Milet, C., Maczkowiak, F., Roche, D. D., Monsoro-Burq, A. H. Pax3 and Zic1 drive induction and differentiation of multipotent, migratory, and functional neural crest in Xenopus embryos. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 5528-5533 (2013).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J., Nieuwkoop, P. D., Faber, J. . Normal table of Xenopus laevis (Daudin): a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , (1994).
- Harland, R. M. In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos. Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).
- Turner, D. L., Weintraub, H. Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate. Genes Dev. 8, 1434-1447 (1994).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Removing the Vitelline Membrane from Xenopus laevis Embryos. CSH protocols. , (2007).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Animal Cap Isolation from Xenopus laevis. CSH protocols. , (2007).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Embryo dissection and micromanipulation tools. CSH protocols. , (2007).
- Wilson, S. W., Houart, C. Review: Early Steps in the Development of the Forebrain. Developmental Cell. 6, 167-181 (2004).
- Juraver-Geslin, H. A., Durand, B. C. Early development of the neural plate: new roles for apoptosis and for one of its main effectors caspase-3. Genesis. 53, 203-224 (2015).
- Heasman, J. Patterning the early Xenopus embryo. Development. 133, 1205-1217 (2006).
- Rubenstein, J. L., Martinez, S., Shimamura, K., Puelles, L. The embryonic vertebrate forebrain: the prosomeric model. Science. 266, 578-580 (1994).
- Puelles, L., Rubenstein, J. L. R. Forebrain gene expression domains and the evolving prosomeric model. Trends in Neurosciences. 26, 469-476 (2003).
- Martinez-Ferre, A., Martinez, S. Molecular regionalization of the diencephalon. Frontiers In Neuroscience. 6, 73-73 (2012).
- Scholpp, S., Lumsden, A. Review: Building a bridal chamber: development of the thalamus. Trends in Neurosciences. 33, 373-380 (2010).
- Coffman, C., Harris, W., Kintner, C. Xotch, the Xenopus homolog of Drosophila notch. Science. 249, 1438-1441 (1990).
- Pera, E. M., Acosta, H., Gouignard, N., Climent, M., Arregi, I. Active signals, gradient formation and regional specificity in neural induction. Exp Cell Res. 321, 25-31 (2014).
- Stern, C. D. Neural induction: old problem, new findings, yet more questions. Development. 132, 2007-2021 (2005).
- Juraver-Geslin, H. A., Ausseil, J. J., Wassef, M., Durand, B. C. Barhl2 limits growth of the diencephalic primordium through Caspase3 inhibition of beta-catenin activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 2288-2293 (2011).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Dissociation and Reaggregation of Xenopus laevis Animal Caps. CSH protocols. , (2007).
- Harland, R. M., Grainger, R. M. Xenopus research: metamorphosed by genetics and genomics. Trends Genet. 27, 507-515 (2011).
- Beccari, L., Marco-Ferreres, R., Bovolenta, P. The logic of gene regulatory networks in early vertebrate forebrain patterning. Mech Dev. 130, 95-111 (2013).
- Pani, A. M., et al. Ancient deuterostome origins of vertebrate brain signalling centres. Nature. 483, 289-294 (2012).
- Holland, L. Z., et al. Evolution of bilaterian central nervous systems: a single origin?. Evodevo. 4, 27 (2013).
- Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets. Disease models & mechanisms. 6, 1057-1065 (2013).
- Sasai, Y., Ogushi, M., Nagase, T., Ando, S. Bridging the gap from frog research to human therapy: a tale of neural differentiation in Xenopus animal caps and human pluripotent cells. Development, growth & differentiation. 50, s47-s55 (2008).
