Cellule staminali simil-<em> Xenopus</em> Embrionali espianti di studiare Caratteristiche precoce dello sviluppo neurale<em> In Vitro</em> E<em> In Vivo</em
Summary
In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.
Abstract
Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.
Introduction
Il sistema nervoso vertebrato emerge dalla piastra neurale come uno strato omogeneo di cellule neuroepiteliali. Comprendere come sono indotte programmi di sviluppo, codificati, e stabilito durante la regionalizzazione della piastra neurale è, allo stato attuale, un obiettivo importante nella biologia dello sviluppo. Rispetto ad altri sistemi, il sperimentalmente suscettibili di Xenopus embrioni è un modello di riferimento per analizzare i primi passi di sviluppo neurale 1,2. E 'facile ottenere un gran numero di embrioni, e sviluppo esterno dà accesso ai primi passi della neurulazione 3. Molti strumenti sono a disposizione per manipolare sperimentalmente Xenopus laevis (X. laevis) lo sviluppo embrionale. Micro-iniezione di mRNA o Morpholinos (MO), tra MO inducibile, insieme agli strumenti biochimiche e farmacologiche, permette di guadagno di funzione (GOF) e perdita di funzione (OL) e determinata alterazione delle vie di segnalazione 4,5 controllato. Il blastocoel tetto ectoderma, situato attorno al polo animale di un blastula, o gastrula embrione molto precoce, e denominato 'Cap Animal' (AC), è una fonte di cellule pluripotenti che può essere programmato da manipolazione genica prima espianti preparazione. In questo manoscritto sono protocolli dettagliati per usare X. espianti laevis AC per testare de vitro e in vivo dei meccanismi molecolari e dei processi cellulari di sviluppo neurale sottostante.
Una tecnica è presentata, permettendo l'osservazione multa di modelli di espressione genica in un tubo neurale girino Xenopus, un passo preliminare per l'identificazione di segnali determinazione destino. Considerando che l'osservazione di tessuti piatto montato è comunemente usato nello studio di embrioni di pollo 6, non è stato correttamente descritto in Xenopus. La manipolazione dell'espressione genica mediante iniezione di mRNA sintetico o MO nei blastomeri di 2 o 4 embrioni stadio cella permette la programmazione di ACespianti 4. Per esempio l'inibizione della proteina morfogenetica (BMP) percorso dalla espressione del movimento anti-BMP fattore Noggin, dà un'identità neurale per celle AC 3. Il protocollo è dettagliata per eseguire esposizione locale e comandato a tempo di espianti AC ai segnali estrinseci tramite contatto diretto con una perlina di resina scambiatrice di anioni. Finalmente una tecnica è descritta per testare le caratteristiche di sviluppo delle progenitori neurali in vivo per il trapianto di espianti miste preparate da cellule distinte programmato dissociate e ri-associati.
L'embrione rana è un potente modello per lo studio precoce sviluppo neurale dei vertebrati. Combinando la manipolazione dell'espressione genica di espianto colture in vitro fornisce importanti informazioni per lo studio di neuroepitelio regionalizzazione, la proliferazione e morfogenesi 7-12. La programmazione di espianti AC consentito lo sviluppo di un cuore funzionale ex vivo 13,14. L'usodi espianto innesto 15 ha portato all'individuazione dello switch trascrizionale minimo indurre il programma di differenziazione cresta neurale 16. Il limitans zona per intrathalamica (ZLI) è un centro di segnalazione che secerne sonic hedgehog (Shh) per controllare la crescita e la regionalizzazione del prosencefalo caudale. Quando continuamente esposto a Shh, le cellule neuroepiteliali coexpressing il fattore geni tre trascrizione – Barh-like homeobox-2 (barhl2), orthodenticle-2 (Otx2) e Iroquois-3 (irx3) – acquistano due caratteristiche del vano ZLI: la competenza a esprimere shh, e la capacità di separare dalle cellule anteriore piastra neurale. Come un sistema modello, l'induzione di un destino ZLI in cellule neuroepiteliali verrà presentato 8.
Questi protocolli mirano a fornire semplici, a basso costo, e strumenti efficienti per i biologi dello sviluppo e altri ricercatori per esplorare il mec fondamentalehanisms di comportamenti chiave delle cellule neurali. Tali protocolli sono molto versatili e permettono la ricerca di una vasta gamma di segnali neurali determinazione estrinseci ed intrinseci. Esso consente a lungo termine de analisi in vivo di impegno lignaggio neurale, interazioni induttive e comportamenti delle cellule.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sviluppo neurale è orchestrata da una complessa interazione tra programmi di sviluppo cellulari e segnali dai tessuti circostanti (Recensito a 3,31,32). Qui si descrive un set di protocolli che possono essere utilizzati de X. laevis embrioni per esplorare fattori estrinseci ed intrinseci coinvolti nella determinazione destino neurale e la morfogenesi neuronale in vitro e in vivo. Questi protocolli possono essere usati come tali X. embrioni tropicalis, tut…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The author thanks Hugo Juraver-Geslin, Marion Wassef and Anne Hélène Monsoro-Burq for their help and advice, and the Animal Facility of the Institut Curie. The author thanks Paul Johnson for his editing work on the manuscript. This work was supported by the Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS UMR8197, INSERM U1024) and by grants from the “Association pour la Recherche sur le Cancer” (ARC 4972 and ARC 5115; FRC DOC20120605233 and LABEX Memolife) and the Fondation Pierre Gilles de Gennes (FPGG0039).
Materials
| Paraformaldehyde | VWR | 20909.290 | Toxic |
| anion exchange resin beads | Biorad | 140- 1231 | |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A-7888 | For culture of animal cappH 7.6 |
| Gentamycine | GIBCO | 15751-045 | antibiotic |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A7906 | for bead preparation |
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