Celular-como Stem<em> Xenopus</em> Embrionarias explantes para Estudiar Características Temprana del Desarrollo Neural<em> In Vitro</em> Y<em> En Vivo</em
Summary
In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.
Abstract
Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.
Introduction
El sistema nervioso de los vertebrados emerge de la placa neural como una capa homogénea de células neuroepiteliales. La comprensión de cómo se inducen los programas de desarrollo, codificados, y establecieron durante la regionalización de la placa neural es, en la actualidad, una meta importante en la biología del desarrollo. En comparación con otros sistemas, el embrión Xenopus experimentalmente susceptible es un modelo de elección para el análisis de los primeros pasos de 1,2 desarrollo neural. Es fácil de obtener un gran número de embriones, y el desarrollo externo da acceso a los primeros pasos de neurulation 3. Muchas herramientas están disponibles para manipular experimentalmente Xenopus laevis (X. laevis) el desarrollo embrionario. Micro-inyección de ARNm o morfolinos (MO), incluyendo OMs inducibles, junto con herramientas bioquímicas y farmacológicas, permite ganancia de función (GOF) y pérdida de función (LOF) y la alteración específica de las vías de señalización 4,5 controlada. El blastocoel techo ectodermo, situado alrededor del polo animal de una blástula, o un embrión gástrula muy temprano, y se refiere como el "Cap Animal '(AC), es una fuente de células pluripotentes que puede ser programado por la manipulación de la expresión génica antes de la explantes preparación. En este manuscrito son protocolos detallados para utilizar X. explantes laevis AC para poner a prueba de vitro e in vivo mecanismos moleculares y procesos celulares desarrollo neuronal subyacente.
Una técnica se presenta, lo que permite la observación multa de patrones de expresión génica en un tubo neural renacuajo Xenopus, un paso preliminar en la identificación de señales de determinación de destino. Considerando que la observación de los tejidos planos montado se utiliza comúnmente en el estudio de embriones de pollo 6, no ha sido descrito adecuadamente pt Xenopus. La manipulación de la expresión génica mediante la inyección de ARNm sintético o MO en los blastómeros de 2 o 4 embriones en fase celular permite la programación de ACexplantes 4. Por ejemplo inhibición de la vía proteína morfogenética ósea (BMP) por la expresión del anti-factor de BMP Noggin, da una identidad neural a las células de CA 3. El protocolo se detalla para llevar a cabo la exposición local y controlada en el tiempo de los explantes de corriente alterna a las señales extrínsecas a través de contacto directo con una perla de resina de intercambio aniónico. Finalmente se describe una técnica para el ensayo de características de desarrollo de los progenitores neurales in vivo mediante trasplante de explantes mixtos preparados a partir de células distintas programado disociados y re-asociados.
El embrión de rana es un poderoso modelo para estudiar el desarrollo neuronal temprana de los vertebrados. La combinación de la manipulación de la expresión génica con la explantación cultivos in vitro proporciona información importante en el estudio de la regionalización neuroepitelio, la proliferación, y la morfogénesis 7-12. La programación de los explantes de CA permitido el desarrollo de un corazón funcional ex vivo 13,14. El usoexplante de injerto 15 condujo a la identificación del interruptor transcripcional mínimo inducir el programa de diferenciación de la cresta neural 16. La zona limitante intratalámica (ZLI) es un centro de señalización que segrega sonic hedgehog (Shh) para controlar el crecimiento y la regionalización del prosencéfalo caudal. Cuando se expone continuamente a Shh, las células neuroepiteliales coexpressing los genes del factor de tres de transcripción – BARH-como homeobox-2 (barhl2), orthodenticle-2 (Otx2) y iroquois-3 (Irx3) – adquieren dos características del compartimento ZLI: la competencia para expresar shh, y la capacidad para segregar a partir de células de la placa neural anterior. Como un sistema modelo, la inducción de un destino ZLI en células neuroepiteliales será presentado 8.
Estos protocolos tienen por objeto proporcionar y herramientas eficientes simples, baratas para los biólogos del desarrollo y otros investigadores para explorar el mec fundamentalhanisms de comportamientos clave de células neuronales. Estos protocolos son muy versátiles y permiten la investigación de una amplia gama de señales de determinación neuronales intrínsecos y extrínsecos. Permite a largo plazo en el análisis in vivo de compromiso de linaje neuronal, interacciones inductivas y comportamientos celulares.
Protocol
Representative Results
Discussion
Desarrollo neuronal es orquestada por una compleja interacción entre los programas de desarrollo celulares y señales de los tejidos circundantes (revisado en 3,31,32). Aquí se describe un conjunto de protocolos que se puede utilizar en X. laevis embriones para explorar factores extrínsecos e intrínsecos que intervienen en la determinación del destino neural y la morfogénesis neuronal in vitro e in vivo. Estos protocolos pueden ser utilizados como tales en X. embrione…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The author thanks Hugo Juraver-Geslin, Marion Wassef and Anne Hélène Monsoro-Burq for their help and advice, and the Animal Facility of the Institut Curie. The author thanks Paul Johnson for his editing work on the manuscript. This work was supported by the Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS UMR8197, INSERM U1024) and by grants from the “Association pour la Recherche sur le Cancer” (ARC 4972 and ARC 5115; FRC DOC20120605233 and LABEX Memolife) and the Fondation Pierre Gilles de Gennes (FPGG0039).
Materials
| Paraformaldehyde | VWR | 20909.290 | Toxic |
| anion exchange resin beads | Biorad | 140- 1231 | |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A-7888 | For culture of animal cappH 7.6 |
| Gentamycine | GIBCO | 15751-045 | antibiotic |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A7906 | for bead preparation |
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