Synthese von thermogelierenden Poly (N-isopropylacrylamid) -Pfropf-Chondroitinsulfat Composites mit Alginate Mikroteilchen für Tissue Engineering

Summary

Injizierbare tissue engineering Gerüst aus Poly (N-isopropylacrylamid) -Pfropf-Chondroitinsulfat Mikroteilchen (PNIPAAm-g-CS) -haltigen Alginat besteht, wurde hergestellt. Die Haftfestigkeit, Quelleigenschaften und Biokompatibilität in vitro sind in dieser Studie untersucht. Die Charakterisierungstechniken hier entwickelt, können auf andere thermogelierende Systeme anwendbar sein.

Abstract

Injizierbaren Biomaterialien als implantierbare Materialien definiert , die in den Körper als eine Flüssigkeit eingeführt werden kann und in situ verfestigt. Solche Materialien bieten die klinischen Vorteile der minimal-invasiv implantiert wird und leicht raumfüllende Feststoffe in unregelmäßig geformten Defekte bilden. Injizierbaren Biomaterialien wurden als Gerüste für Tissue Engineering umfassend untersucht. Jedoch für die Reparatur von bestimmten lasttragenden Bereiche im Körper, wie beispielsweise die Bandscheibe sollte Scaffolds Klebeigenschaften besitzen. Dadurch wird die Gefahr der Dislokation während der Bewegung zu minimieren und einen innigen Kontakt mit dem umgebenden Gewebe gewährleistet, eine ausreichende Kraftübertragung bereitstellt. Hier beschreiben wir die Herstellung und Charakterisierung eines Gerüstes, bestehend aus thermisch sensitive poly (N-Isopropylacrylamid) -Pfropf-Chondroitinsulfat (PNIPAAm-g-CS) und Alginat-Mikropartikel. Die PNIPAAm-g-CS-Copolymer bildet eine viskose Lösung in Wasser bei RT, in die alginate Partikel suspendiert Adhäsion zu verbessern. Oberhalb der unteren kritischen Lösungstemperatur (LCST), um die 30 ° C, bildet das Copolymer ein festes Gel um die Mikropartikel. Wir haben Standard Biomaterialien Charakterisierungsverfahren angepasst zu berücksichtigen, die reversible Phasenübergang von PNIPAAm-g-CS. Die Ergebnisse zeigen, dass der Einbau von 50 oder 75 mg / ml Alginat Partikel in 5% (w / v) PNIPAAm-g-CS-Lösungen die Haftzugfestigkeit von PNIPAAm-GCS allein (p <0,05) zu vervierfachen. Der Einbau von Alginat-Mikropartikel ebenfalls wesentlich erhöht Quellungsvermögen PNIPAAm-g-CS (p <0,05) und hilft, eine raumfüllende Gel innerhalb von Gewebedefekten zu halten. Schließlich Ergebnisse der in vitro – Toxikologie-Testkit, 2,3-bis- (2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl) -2H-tetrazolium-5-carboxanilid (XTT) und Live / Dead Lebensfähigkeitstest zeigen , dass die Klebstoff in der Lage ist, das Überleben und die Proliferation von verkapselten menschliche embryonale Nierenstütz (HEK) 293-cells über 5 Tage.

Introduction

Injizierbaren Biomaterialien sind diejenigen , die bequem in den Körper als eine Flüssigkeit geliefert werden und in situ verfestigen. Solche Materialien wurden ausführlich in der regenerativen Medizin angewendet, wo sie für die Zellen ⁵ werden verwendet , um eingekapselten Zellen in das betroffene Seite ^1-4 und wirken als dreidimensionale temporäre extrazellulären Matrix zu liefern. Für den Patienten sind injizierbare Biomaterialien vorteilhaft, weil die chirurgische Verfahren zur Implantation minimal invasiv sind und die feste Phase unregelmäßig Gewebedefekte zu füllen geformt, wodurch die Notwendigkeit für kundenspezifische Größe Implantate zu beseitigen.

Injizierbarkeit kann durch eine Vielzahl von Mechanismen erreicht werden. Externe Faktoren, wie pH – Wert, wurden als Auslöser für die Bildung von Gelen untersucht , die ^6-8 – Zellen und bioaktiven Molekülen einzukapseln. Jedoch pH darf nicht die praktischste Trigger sein, alle physiologischen Umgebungen zu verwenden, bei. Ein weiteres traditionelles Alternative für Einspeiseleistung Erreichung der in situ chemische Polymerisation oder Vernetzung verwendet. Eine Gruppe entwickelt , die ein wasserlösliches Redoxsystem bestehend aus Ammoniumpersulfat und N, N, N ', N' N' – Tetramethylethylendiamin und verwendet sie für Makromere , bestehend aus Polyethylenglykol und Poly (propylen) glycol ^9,10 reagiert. Zan et al. ¹¹ entwickelten injizierbare Chitosan Polyvinylalkohols Netzwerke vernetzt mit Glutaraldehyd. In solchen Systemen muß die Zytotoxizität von reaktiven Komponenten in Betracht gezogen werden, insbesondere für Anwendungen, bei denen Zell Verkapselung. Auch könnte exotherme Polymerisation hoch genug Temperaturen erzeugen umgebende Gewebe zu beeinträchtigen, über die berichtet wurde , für polymere Knochenzemente ^12,13.

Noch andere injizierbare Polymersysteme entwickelt worden, die einen Wechsel von der flüssigen in den festen Zustand mit der Temperatur als Auslöser aufweisen. Bekannt als thermogelierende Systeme, das sind aqueous Polymerlösungen , die de – situ – Bildung zu erzielen ¹⁴ keine chemischen Stimulus, Monomere oder Vernetzer erfordern. Vielmehr üblicherweise ein Phasenübergang in der Nähe von physiologischen Temperatur auftretenden induziert die Bildung eines physikalisch vernetzten dreidimensionalen Netzwerk. Poloxamere wie Pluronic F127 gehören zu den am häufigsten untersuchten Polymere für thermogelierenden Arzneimittelverabreichungs ^15-17 und Zellverkapselung ^18,19. Es ist jedoch allgemein anerkannt, dass diese Gele Stabilität bei physiologischen Bedingungen fehlen. Studien haben gezeigt , eine erhöhte Stabilität ^21,22 mit Kettenverlängerungs ²⁰ oder chemischen Vernetzer. Dennoch ist die Verwendung dieser Reagenzien kann das Potential der Materialien für die Verkapselung von Zellen begrenzen.

Poly (N-isopropylacrylamid) ist ein synthetisches thermogelierende Polymer , das ¹⁴ große Aufmerksamkeit im Tissue Engineering und Drug Delivery erhalten hat. Wässrige Lösungen von Poly (N-isopropylacrylamide) (PNIPAAm) zeigen eine untere kritische Lösungstemperatur (LCST), auftretende typischerweise etwa 32 bis 34 ° C ^23,24. Unterhalb der LCST, Hydrate Wasser PNIPAAm Ketten. Oberhalb der Übergangstemperatur wird das Polymer hydrophob, was zu einer dramatischen Phasentrennung ^25-27 und die Bildung eines festen Gels , ohne die Verwendung von toxischen Monomere oder Vernetzer. Jedoch zeigen PNIPAAm Homo elastischen Eigenschaften schlecht und wenig Wasser bei physiologischer Temperatur halten aufgrund der Hydrophobizität ^28. In dieser Arbeit wählen wir Chondroitinsulfat kovalent in das PNIPAAm Netzwerk zu integrieren, die das Potenzial für die enzymatische Abbaubarkeit bietet ^29, anti-inflammatorische Aktivität ^30,31 und erhöhte Wasser- und Nährstoffaufnahme ^32. PNIPAAm Copolymere mit CS wurden in unserem Labor hergestellt, indem das Monomer NIPAAm in Gegenwart von Methacrylat-funktionalisierten CS Polymerisieren gepfropfte Copolymer (PNIPAAm-g-CS) zu bilden. BecAUSE der geringen Vernetzungsdichte des Copolymers bildet PNIPAAm-g-CS eine viskose Lösung in Wasser bei RT und ein elastisches Gel bei physiologischer Temperatur aufgrund der LCST ^29. Die Polymerlösungen werden erneut fließfähig auf unterhalb der LCST Abkühlung aufgrund der Reversibilität des Übergangs.

Wir haben gezeigt , dass PNIPAAm-g-CS das Potential hat als Tissue Engineering Gerüst zu dienen, aufgrund von mechanischen Eigenschaften , die angepasst werden können, Abbaubarkeit und cytocompatibility mit humanen embryonalen Niere (HEK) 293 – Zellen ^29. Jedoch in bestimmten lasttragenden Bereichen, wie der Bandscheibe, Tissue Engineering Scaffolds sollte die Fähigkeit haben , eine wesentliche Schnittstelle mit umgebenden Scheibengewebe zu bilden , das Risiko einer Luxation ³³ zu beseitigen. Diese Schnittstelle ist auch notwendig für die angemessene Kraftübertragung über die Grenzfläche zwischen dem Implantat und dem Gewebe ^33. In unserer Arbeit haben wir ausgesetzt einlginate Mikropartikel in wässerigen Lösungen von PNIPAAm-g-CS und fanden , daß eine Gelierung der Mikropartikel lokalisiert, die mit ³⁴ umgebendes Gewebe Adhäsion bereitzustellen. In diesem Papier beschreiben wir die Schritte zur Herstellung des thermogelierende, Klebstoffpolymer. Standardtechniken zur Charakterisierung von Biomaterialien, Cell Imaging und Assays für die Lebensfähigkeit wurden die Temperaturempfindlichkeit des Polymers und die Reversibilität der Phasenübergang zu berücksichtigen angepasst. Die injizierbare Polymer in diesem Papier beschrieben hat breite Potenzial für die Arzneimittelabgabe und Tissue-Engineering-Anwendungen außerhalb der in diesem Papier beschrieben. Außerdem hier beschriebenen Charakterisierungsmethoden können auf andere thermogelierende Systeme anwendbar sein.

Protocol

1. Poly (N-isopropylacrylamid) -g-Chondroitinsulfat Synthesis Vor der Synthese des bioadhäsive Hydrogel, zu reinigen N-Isopropylacrylamid (NIPAAm) monomer und Methacrylat Chondroitinsulfat (CS). Gewicht von mindestens 10 g NIPAAm und das Monomer in 400 ml n-Hexan bei 60 ° C auflösen. Rühren Sie die Behälter in regelmäßigen Abständen bis zur vollständigen Auflösung. Rekristallisieren der Lösung in einem -20 ° C Gefrierschrank für 24 Stunden. Entfernen des kristallisierten Monome…

Representative Results

Eine thermisch ansprechende gepfropfte Copolymer wurde erfolgreich synthetisiert und auf ihre bioadhäsiven Festigkeit, Quelleigenschaften und in vitro cytocompatibility. Wir entschieden uns für Alginat zu untersuchen, aufgrund seiner etablierten mucoadhäsive Eigenschaften. Alginat-Mikropartikel mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 59,7 ± 14,9 um wurden mit 5% gemischt (w / v) PNIPAAm-g-CS bei Konzentrationen von 25, 50 und 75 mg / ml. Diese Konzentrationen wurden auf…

Discussion

Es gibt mehrere wichtige Schritte, um das Hydrogel-Mikropartikel-Composite bei der Synthese und seine Haftfestigkeit der Bewertung, Quellfähigkeit und zelluläre Biokompatibilität. Radikalische Polymerisation von PNIPAAm-g-CS erfordert eine erfolgreiche Methacrylierung von Chondroitinsulfat, eine vollständige Auflösung der Monomerkomponenten und sauerstofffreie Reaktionsbedingungen. Das Verhältnis von Monomer zu NIPAAm methacrylierte Chondroitinsulfat in dem Reaktionsgemisch wurde gewählt , weil es in unserer frü…

Materials

N-isopropylacrylamide, 99%, pure, stabilized	Acros Organics	2210-25-5	Refrigerate and remove stabilier with hexane
Chondroitin sulfate A sodium salt (from bovine trachea)	Sigma-Aldrich	39455-18-0	Refrigerate
Hexanes	Fisher Scientific	H302-4	Store in a flammable cabinet
50% (w/w) sodium hydroxide	Fisher Scientific	SS254-1	Caustic in nature
Methacrylic anhydride	Sigma-Aldrich	276685	Strong fumes; use in a fume hood
Acetone	Fisher Scientific	A18-4	Chill in a refrigerator prior to use
Nitrogen Gas	Praxair	7727-37-9	Part Number: NI 4.8, cylinder style T, 99.998% pure nitrogen (Argon may be used as an alternative inert gas)
Tetramethylethylenediamine, 99% extra pure	Acros Organics	110-18-9
Ammonium persulfate	Sigma Aldrich	A3678	Hygroscopic and degrades in the presence of water
Phosphate buffered saline tablets	Fisher Scientific	BP2944	Keep dry
Alginic acid, sodium salt	Acros Organics	177775000	Use heat to aid in dissolving
Calcium chloride dihydrate	Fisher Scientific	C79
Canola oil	Local store		Obtain from a local store
Tween 20	Sigma-Aldrich	93773
70% (v/v) Isopropoanol	Fisher Scientific	A416-4
Porcine ears	Haine's Pork Shop		Obtain from a local butcher
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S271-3
Human embryonic kidney 293 cells	ATCC	ATCC CRL-1573	Store in liquid nitrogen for long-term use
DMEM: 1X, high glucose, no pyruvate	Life Technologies	11965126	Refrigerate
Fetal bovine serum	Life Technologies	10082-147	Refrigerate
Penn Strep: 10,000 U/ml	Life Technologies	15140-122	Refrigerate
Trypsin-EDTA: 0.5%, 10X	Life Technologies	15400-054	Refrigerate
Methanol	VWR	AAA44571-K7
Live/Dead Cell viability kit	Life Technologies	L3224	Light sensitive, keep frozen
XTT cell viability kit	Sigma Aldrich	TOX2-1KT	Light sensitive, keep frozen
Clear DMEM: 1X, high glucose, no phenol	Life Technologies	21063-029	Refrigerate
Dulbecco's PBS: 1X	Life Technologies	14190136	Refrigerate
Sodium citrate	EMD	SX0445-1
Positive displacement pipette	BrandTech Scientific, INC	2702904	Dispenses 100 – 500 µL and comes with attachable tips
No 3. Stainless Steel scalpel handle	Sigma Aldrich	S2896
Miltex sterile surgical blades	Fisher Scientific	12-460-440	Size 10
Power gem homogenizer	Fisher Scientific	08-451-660	Model # 125
Porcelain mortar and pestle	Sigma Aldrich	Z247464	Holds 50 mL
FreeZone 1 L benchtop freeze dry system	Labconco	7740020	Freeze samples prior to use
Oil sealed rotary vane pump	Edwards	A65301906	Model # RV5
Incubating orbital shaker	VWR	12620-946	Model # 980153
Benchtop refrigerated centrifuge	Forma Scientific, INC		Model # 5682
Heated ovens	VWR		Model # 1235PC
2 N force gauge	Shimpo	FGV-0.5XY	Model # FGV-0.5XY
E-force test stand	Shimpo	FGS-200PV	Model # FGS-200PV
Tissue culture swinging bucket centrifuge	Beckman Coulter	366830	Model #6S-6KR
Tissue culture microcentrifuge	Eppendorf		Model #5415C
Hemacytometer set	Hausser Scientific	3720	Requires replacement cover glass slips
Slide warmer	Lab Scientific	XH-2022	Model # XH-2002
Portable heating lamp	Underwriters Laboratories		Helps to maintain polymer temperature at 37°C
Inverted fluorescent microscope	Zeiss		Model Axiovert 25 CFL
Heated water bath	VWR		Model # 1235PC
Rocking platform	VWR		Series 100
Multiskan FC microtiter plate reader	Thermo Scientific		Type 357
Cell culture incubator	VWR		Model # 2350T
Purifier class II biosafety cabinet	Labconco		Delta Series