組織工学のためのアルギン酸微粒子と熱ゲルポリ（N-イソプロピルアクリルアミド） - グラフト - コンドロイチン硫酸複合材料の合成
Summary
ポリ（N-イソプロピルアクリルアミド） – グラフト – コンドロイチン硫酸からなる注射可能な組織工学足場は、（のPNIPAAm-G-CS）含有アルギン酸微粒子を調製しました。接着強度、膨潤性及び生体適合性、インビトロでは、この研究で分析されています。ここで開発された特性決定技術は、他の熱ゲル化システムにも適用可能です。
Abstract
注射可能な生体材料は、液体として体内に導入し、 その場で固化することができる移植可能な材料として定義されます。このような材料は、不規則な形状の欠陥で空間充填固形物を形成する低侵襲かつ容易に注入されるの臨床的利点を提供します。注射用生体材料は、広く組織工学のための足場として研究されてきました。しかし、体内の特定の耐荷重領域の修復のために、このような椎間板のように、足場は、接着性を有するべきです。これは、力の適切な伝達を提供し、動作中の転位の危険を最小限にし、周囲の組織との密接な接触を確実にします。ここでは、熱に敏感なポリ（N-イソプロピルアクリルアミド） – グラフト – コンドロイチン硫酸（PNIPAAM-G-CS）およびアルギン酸微粒子から成る足場の調製および特徴を説明します。 PNIPAAm-G-CS共重合体はalginatに、室温で水に粘性の溶液を形成しますE粒子は、接着を増強するために中断されています。下限臨界溶液温度（LCST）より、30℃の周囲に、共重合体は、微粒子の周囲に固体ゲルを形成します。我々は考慮のPNIPAAm-G-CSの可逆的な相転移を取るために、標準的な生体材料の特性評価の手順を適応しています。結果は、単独のPNIPAAm-GCSの5％に50または75 mg / mlでアルギン酸塩粒子の取り込みが（W / V）のPNIPAAm-G-CSのソリューションすなわち四接着引張強度（P <0.05）を示します。アルギン酸微粒子の混入も大幅組織欠損内空間充填ゲルを維持するのを助ける、のPNIPAAm-G-CS（p <0.05）の膨潤容量を増加させます。最後に、 中の結果インビトロ毒性アッセイキット、2,3-ビス- （2-メトキシ-4-ニトロ-5-スルホフェニル）-2H-テトラゾリウム-5- carboxanilide（XTT）および生/死生存率アッセイであることを示します接着剤は、カプセル化されたヒト胚腎臓の生存および増殖（HEK）293 Cをサポートすることが可能です5日間のells。
Introduction
注射可能な生体材料は、好都合には液体として体内に送達され、 その場で固化することができるものです。このような材料は、それらが細胞5ための三次元の一時的細胞外マトリックスとして患部1-4及び行為をカプセル化細胞を送達するために使用される再生医療に広く適用されています。移植のための外科的処置は、低侵襲であり、固相は、カスタムサイズのインプラントの必要性を排除し、不規則な形状の組織欠陥を埋めることができるため、患者のために、注射可能な生体材料は、有利です。
注入は、種々の機構を介して達成することができます。外部要因は、pH値のような、細胞および生物活性分子を封入6-8ゲルを形成するためのトリガとして研究されてきました。しかし、pHが全ての生理学的環境で使用するための最も便利な引き金ではないかもしれません。もう一つの伝統的なオルタナ注入を達成するための的は、 現場での化学重合または架橋を使用しています。グループは、過硫酸アンモニウムからなる水溶性のレドックス系を開発し、N、N、N '、N' -tetramethylethylenediamine 9,10-グリコール、ポリエチレングリコール、ポリ（プロピレン）からなるマクロマーを反応させるために使用されます。斬ら 11先進注射用キトサンポリビニルアルコールネットワークは、グルタルアルデヒドで架橋されました。このようなシステムでは、反応性成分の細胞毒性は、特に、細胞のカプセル化を伴う用途では、考慮しなければなりません。また、発熱重合は、ポリマー骨12,13をセメントで報告されている周辺組織を、妥協するのに十分高い温度を作り出すことができます。
さらに他の注射可能なポリマー系は、トリガとしての温度で液体から固体状態に変化を示すが開発されています。熱ゲル化システムとして知られ、これらはaqueoあります私たちのその場の形成14 に達成するために、化学的刺激、モノマー、または架橋剤を必要としないのポリマー溶液。そうではなく、通常の生理学的温度付近に生じる相転移が物理的に架橋された三次元網目構造の形成を誘導します。プルロニックF127などのポロキサマーは、薬物送達15-17と細胞封入18,19を熱ゲルのための最も広く研究されているポリマーの中です。しかし、これらのゲルは、生理的条件での安定性を欠くことがよく認められています。研究は、連鎖延長20または化学的架橋剤21,22を使用して増大した安定性を実証しています。それにもかかわらず、これらの試薬を使用することは、細胞のカプセル化のための材料の可能性を制限することができます。
ポリ（N-イソプロピルアクリルアミド）は、組織工学および薬物送達14に注目された合成熱ゲル化ポリマーです。ポリの水溶液（N-isoprop34°C 23,24 – ylacrylamide）（のPNIPAAm）は、典型的には約32起こる、下限臨界溶液温度（LCST）を示します。 LCSTより下では、水がのPNIPAAmチェーンを水和します。転移温度より上、ポリマーは、毒性モノマー又は架橋剤を使用せずに劇的な相分離25-27と固体ゲルの形成をもたらす、疎水性になります。しかし、のPNIPAAmホモポリマーが悪い弾性特性を示し、原因疎水28に生理的温度で少量の水を保持します。本研究では、酵素分解性29、抗炎症活性30,31、および増加した水と栄養吸収の32の可能性を提供するのPNIPAAmネットワーク、に共有結合コンドロイチン硫酸を組み込むことを選択します。 CSとのPNIPAAm共重合体は、グラフトされた共重合体（のPNIPAAm-G-CS）を形成するメタクリレート官能CSの存在下でモノマーNIPAAMを重合することによって我々の研究室で調製しました。ベック共重合体の低架橋密度のause、のPNIPAAm-G-CSは室温で水に粘性溶液とによるLCST 29に生理的温度での弾性ゲルを形成します。ポリマー溶液は、期限付き遷移の可逆に再びLCST以下に冷却すると流動可能になります。
我々は、のPNIPAAm-G-CSは、組織工学調整することができ、機械的特性に起因する足場、分解性、及びヒト胚腎臓（HEK）細胞適合性を有する293細胞29として機能する可能性があることを実証しました。しかし、このような椎間板のような特定の耐荷重領域において、組織工学足場は、転位33のリスクを排除するために周囲の椎間板組織との実質的な界面を形成する能力を有するべきです。このインタフェースは、インプラントと組織33との間の界面を横切る力を適切に伝達するためにも必要です。私たちの仕事では、我々は一時停止していますlginateのPNIPAAm-G-CSの水溶液中の微粒子とは、ゲル化が組織34を囲むとの密着性を提供する微粒子を、局在することがわかりました。本稿では、熱ゲル、接着剤ポリマーの製造のための手順を説明します。生体材料の特徴付け、細胞画像化、および生存能力についてのアッセイのための標準的な技術を考慮ポリマーと相転移の可逆性の温度感受性を取るように適合させました。この論文に記載の注射用ポリマーはこの論文に記載されているものの外薬物送達および組織工学アプリケーションのための幅広い可能性を秘めています。また、ここで説明する特徴付け方法は、他の熱ゲル化システムにも適用可能です。
Protocol
Representative Results
Discussion
ヒドロゲル微粒子複合体を合成し、その接着強度、腫れ能力、および細胞の生体適合性を評価する上でいくつかの重要なステップがあります。 PNIPAAm-G-CSのフリーラジカル重合は、コンドロイチン硫酸の成功メタクリルモノマー成分の完全な溶解、および無酸素反応条件を必要とします。天然の椎間板組織29と同様の機械的特性を有する共重合体を生成するために、我々の以前の研究?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者は感謝して接着剤の引張試験プロトコルの開発で博士ジェニファーKadlowecの支援を感謝したいです。
この刊行物で報告された研究は、関節炎と筋骨格系および皮膚疾患の国立研究所賞番号1R15のAR 063920から01の下で医学や国立衛生研究所の生物工学研究所によってサポートされていました。内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を示すものではありません。
Materials
| N-isopropylacrylamide, 99%, pure, stabilized | Acros Organics | 2210-25-5 | Refrigerate and remove stabilier with hexane |
| Chondroitin sulfate A sodium salt (from bovine trachea) | Sigma-Aldrich | 39455-18-0 | Refrigerate |
| Hexanes | Fisher Scientific | H302-4 | Store in a flammable cabinet |
| 50% (w/w) sodium hydroxide | Fisher Scientific | SS254-1 | Caustic in nature |
| Methacrylic anhydride | Sigma-Aldrich | 276685 | Strong fumes; use in a fume hood |
| Acetone | Fisher Scientific | A18-4 | Chill in a refrigerator prior to use |
| Nitrogen Gas | Praxair | 7727-37-9 | Part Number: NI 4.8, cylinder style T, 99.998% pure nitrogen (Argon may be used as an alternative inert gas) |
| Tetramethylethylenediamine, 99% extra pure | Acros Organics | 110-18-9 | |
| Ammonium persulfate | Sigma Aldrich | A3678 | Hygroscopic and degrades in the presence of water |
| Phosphate buffered saline tablets | Fisher Scientific | BP2944 | Keep dry |
| Alginic acid, sodium salt | Acros Organics | 177775000 | Use heat to aid in dissolving |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientific | C79 | |
| Canola oil | Local store | Obtain from a local store | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | 93773 | |
| 70% (v/v) Isopropoanol | Fisher Scientific | A416-4 | |
| Porcine ears | Haine's Pork Shop | Obtain from a local butcher | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Human embryonic kidney 293 cells | ATCC | ATCC CRL-1573 | Store in liquid nitrogen for long-term use |
| DMEM: 1X, high glucose, no pyruvate | Life Technologies | 11965126 | Refrigerate |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10082-147 | Refrigerate |
| Penn Strep: 10,000 U/ml | Life Technologies | 15140-122 | Refrigerate |
| Trypsin-EDTA: 0.5%, 10X | Life Technologies | 15400-054 | Refrigerate |
| Methanol | VWR | AAA44571-K7 | |
| Live/Dead Cell viability kit | Life Technologies | L3224 | Light sensitive, keep frozen |
| XTT cell viability kit | Sigma Aldrich | TOX2-1KT | Light sensitive, keep frozen |
| Clear DMEM: 1X, high glucose, no phenol | Life Technologies | 21063-029 | Refrigerate |
| Dulbecco's PBS: 1X | Life Technologies | 14190136 | Refrigerate |
| Sodium citrate | EMD | SX0445-1 | |
| Positive displacement pipette | BrandTech Scientific, INC | 2702904 | Dispenses 100 – 500 µL and comes with attachable tips |
| No 3. Stainless Steel scalpel handle | Sigma Aldrich | S2896 | |
| Miltex sterile surgical blades | Fisher Scientific | 12-460-440 | Size 10 |
| Power gem homogenizer | Fisher Scientific | 08-451-660 | Model # 125 |
| Porcelain mortar and pestle | Sigma Aldrich | Z247464 | Holds 50 mL |
| FreeZone 1 L benchtop freeze dry system | Labconco | 7740020 | Freeze samples prior to use |
| Oil sealed rotary vane pump | Edwards | A65301906 | Model # RV5 |
| Incubating orbital shaker | VWR | 12620-946 | Model # 980153 |
| Benchtop refrigerated centrifuge | Forma Scientific, INC | Model # 5682 | |
| Heated ovens | VWR | Model # 1235PC | |
| 2 N force gauge | Shimpo | FGV-0.5XY | Model # FGV-0.5XY |
| E-force test stand | Shimpo | FGS-200PV | Model # FGS-200PV |
| Tissue culture swinging bucket centrifuge | Beckman Coulter | 366830 | Model #6S-6KR |
| Tissue culture microcentrifuge | Eppendorf | Model #5415C | |
| Hemacytometer set | Hausser Scientific | 3720 | Requires replacement cover glass slips |
| Slide warmer | Lab Scientific | XH-2022 | Model # XH-2002 |
| Portable heating lamp | Underwriters Laboratories | Helps to maintain polymer temperature at 37°C | |
| Inverted fluorescent microscope | Zeiss | Model Axiovert 25 CFL | |
| Heated water bath | VWR | Model # 1235PC | |
| Rocking platform | VWR | Series 100 | |
| Multiskan FC microtiter plate reader | Thermo Scientific | Type 357 | |
| Cell culture incubator | VWR | Model # 2350T | |
| Purifier class II biosafety cabinet | Labconco | Delta Series |
Referências
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