Синтез Thermogelling поли (N-изопропилакриламида) -graft-хондроитинсульфат композиты с альгинатом микрочастицами для тканевой инженерии
Summary
Инъекционный тканевой инженерии подмости состоят из поли (N-изопропилакриламида) -graft-хондроитинсульфат получали (PNIPAAm-г-CS) -содержащие микрочастицы альгината. Адгезионная прочность, способность к набуханию и в пробирке биосовместимости анализируются в данном исследовании. Методы определения характеристик, разработанные здесь, могут быть применимы к другим системам thermogelling.
Abstract
Инъекционные биоматериалы определяются как имплантируемые материалы , которые могут быть введены в организм в виде жидкости и затвердевают на месте. Такие материалы обеспечивают клинические преимущества имплантации минимально инвазивным и легко образуя заполняющей пространство твердых веществ в неправильной формы дефектов. Инъекционные биоматериалы широко исследованы в качестве Каркасы для тканевой инженерии. Тем не менее, для ремонта некоторых несущих областей в организме, такие как межпозвоночный диск, каркасы должны обладать адгезивными свойствами. Это позволит свести к минимуму риск дислокации во время движения и обеспечить плотный контакт с окружающей тканью, обеспечивая адекватную передачу усилий. Здесь мы опишем подготовку и характеристику помост, состоящей из термочувствительного поли (N-изопропилакриламида) -graft-хондроитин сульфат (PNIPAAM-г-CS) и альгината микрочастицы. Сополимер PNIPAAm-г-CS образует вязкий раствор в воде при комнатной температуре, в котором альгинате частицы взвешены для улучшения адгезии. Над нижней критической температурой растворения (НКТР), около 30 ° C, сополимер образует твердый гель вокруг микрочастицами. Мы адаптировали стандартные процедуры биоматериалы характеризации учитывать обратимый фазовый переход PNIPAAm-G-CS. Результаты показывают, что введение 50 или 75 мг альгинатных частиц / мл в 5% (вес / объем) растворов PNIPAAm-г-CS вчетверо адгезионная прочность на разрыв PNIPAAm-ГКС в одиночку (р <0,05). Включение альгинатных микрочастиц также значительно увеличивает набухаемость PNIPAAm-G-CS (р <0,05), что помогает поддерживать заполняющей пространство гель внутри дефектов тканей. И, наконец, результаты пробирке токсикологии набора для анализа в, 2,3-бис- (2-метокси-4-нитро-5-сульфофенил) -2H-тетразолия-5-carboxanilide (ХТТ) и Живой / Мертвый анализа жизнеспособности показывают , что клей способен поддерживать выживание и пролиферацию инкапсулированного эмбриональной почки человека (НЕК) 293 гргезов в течение 5 дней.
Introduction
Инъекционные биоматериалы являются те , которые могут быть удобно доставлены в организм в виде жидкости и затвердевает на месте. Такие материалы широко применяются в регенеративной медицине, где они используются для доставки инкапсулированные клетки на пораженное место 1-4 и действовать в качестве трехмерной временной внеклеточного матрикса для клеток 5. Для пациента, инъекционные биоматериалы являются предпочтительными, так как хирургические процедуры имплантации являются минимально инвазивной и твердая фаза может заполнить неправильной формы дефектов тканей, устраняя необходимость в имплантатах нестандартного размера.
Нагнетаемости может быть достигнуто с помощью различных механизмов. Внешние факторы, как рН, были исследованы в качестве триггера для образования гелей , которые инкапсулируют клетки и биологически активные молекулы 6-8. Тем не менее, рН может быть не самым удобным триггер для использования во всех физиологических условиях. Другой традиционный альтернаный для достижения Нагнетаемость используется на месте химической полимеризации или сшиванию в. Группа разработала водорастворимый окислительно – восстановительной системы , состоящей из персульфата аммония и N, 'N' тетраметилэтилендиамина N, N и использовали его для взаимодействия макромеры , состоящие из полиэтиленгликоля и поли (пропилен) гликоль 9,10. Зан и др. 11 развитых инъекционные хитозан поливиниловый сети сшивают с помощью глутаральдегида. В таких системах, цитотоксичность реактивных компонентов необходимо учитывать, особенно для применений, связанных с клеточной инкапсуляция. Кроме того , экзотермическая полимеризация может произвести достаточно высоких температур , чтобы поставить под угрозу окружающие ткани, о котором было сообщено на полимерную костные цементы 12,13.
Тем не менее другие инъекционные полимерные системы были разработаны, которые демонстрируют переход от жидкого состояния в твердое состояние с температурой в качестве триггера. Известные как системы thermogelling, это aqueoнам полимерные растворы , которые не требуют химического стимула, мономеров или сшиватели для достижения в образовании на месте 14. Скорее всего, происходит фазовый переход, как правило, происходит вблизи физиологической температуре вызывает образование физически сшитый трехмерной сети. Полоксамеры , такие как Pluronic F127 являются одними из наиболее широко изученных полимеров для thermogelling доставки лекарственных средств и клеток 15-17 инкапсуляцию 18,19. Тем не менее, хорошо принято считать, что эти гели нестабильны при физиологических условиях. Исследования показали повышенную стабильность при помощи удлинителей цепи 20 или химические сшиватели 21,22. Тем не менее, использование этих реагентов может ограничить потенциал материалов для клеточного инкапсулирования.
Поли (N-изопропилакриламид) представляет собой синтетический thermogelling полимер , который получил значительное внимание в тканевой инженерии и доставки лекарственных средств 14. Водные растворы поли (N-isopropилакриламида) (PNIPAAm) демонстрируют более низкую критическую температуру раствора (НКТР), как правило , происходит около 32 – 34 ° C 23,24. Ниже НКТР, вода гидратов PNIPAAm цепи. Выше температуры перехода, полимер становится гидрофобным, что приводит к резкому разделению фаз и 25-27 образованием твердого геля без использования токсичных мономеров или сшивающих агентов. Тем не менее, PNIPAAm гомополимеры демонстрируют плохие упругие свойства и удерживать небольшое количество воды при физиологической температуре из – за гидрофобности 28. В этой работе, мы решили включить хондроитин сульфат , ковалентно в сеть PNIPAAm, которая открывает возможности для ферментативного расщеплению 29, противовоспалительной активности 30,31 и увеличение воды и поглощение питательных веществ 32. PNIPAAm сополимеры с CS получали в нашей лаборатории путем полимеризации мономерной NIPAAm в присутствии метакрилата-функционализированного CS с образованием привитой сополимер (PNIPAAm-г-CS). BecAUSE низкой плотности сшивки сополимера, PNIPAAm-г-CS образует вязкий раствор в воде при комнатной температуре и эластичный гель при физиологической температуре из – за НКТР 29. Растворы полимеров становятся текучими снова при охлаждении ниже НКТР благодаря обратимости перехода.
Мы показали , что PNIPAAm-г-CS имеет потенциал , чтобы функционировать в качестве тканевой инженерии строительные леса, из – за механических свойств , которые могут быть адаптированы, к расщеплению и cytocompatibility с эмбриональной почки человека (НЕК) 293 клетках 29. Тем не менее, в некоторых несущих нагрузки областях, таких как межпозвоночный диск, тканевой инженерии каркасы должны иметь возможность сформировать значительный интерфейс с окружающей тканью диска , чтобы исключить риск дислокации 33. Этот интерфейс также необходим для адекватной передачи силы через границу раздела между имплантатом и тканью 33. В нашей работе, мы приостановилиlginate микрочастицы в водных растворах PNIPAAm-G-CS и обнаружили , что гелеобразование локализует микрочастицы, которые обеспечивают сцепление с окружающей тканью 34. В этой статье мы опишем шаги для подготовки thermogelling, липкого полимера. Стандартные методы для биоматериалов характеристик, визуализации клеток, а также тесты на жизнеспособность были адаптированы учитывать чувствительность температуры полимера и обратимость фазового перехода. Полимер инъекционный описанный в этой статье имеет большой потенциал для доставки лекарств и тканевой инженерии применения вне описанных в данной статье. Кроме того, методы определения характеристик, описанные здесь, могут быть применимы и к другим системам thermogelling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Есть несколько важных шагов в синтезе гидрогель-микрочастицы композита и оценки ее прочности сцепления, способность к набуханию и клеточный биосовместимость. Радикальной полимеризации PNIPAAm-G-CS требует успешного methacrylation хондроитинсульфата, полное растворение компонентов мономера и у…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы выразить искреннюю признательность за помощь доктора Дженнифер Kadlowec в разработке протокола испытаний на растяжение клея.
В исследовании, опубликованном в данной публикации, была поддержана Национальным институтом артрита и костно-мышечной и кожных заболеваний и Национального института биомедицинской визуализации и биоинженерии Национального института здравоохранения в рамках премии номер 1R15 AR 063920-01. Содержание исключительно ответственности авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национального института здоровья.
Materials
| N-isopropylacrylamide, 99%, pure, stabilized | Acros Organics | 2210-25-5 | Refrigerate and remove stabilier with hexane |
| Chondroitin sulfate A sodium salt (from bovine trachea) | Sigma-Aldrich | 39455-18-0 | Refrigerate |
| Hexanes | Fisher Scientific | H302-4 | Store in a flammable cabinet |
| 50% (w/w) sodium hydroxide | Fisher Scientific | SS254-1 | Caustic in nature |
| Methacrylic anhydride | Sigma-Aldrich | 276685 | Strong fumes; use in a fume hood |
| Acetone | Fisher Scientific | A18-4 | Chill in a refrigerator prior to use |
| Nitrogen Gas | Praxair | 7727-37-9 | Part Number: NI 4.8, cylinder style T, 99.998% pure nitrogen (Argon may be used as an alternative inert gas) |
| Tetramethylethylenediamine, 99% extra pure | Acros Organics | 110-18-9 | |
| Ammonium persulfate | Sigma Aldrich | A3678 | Hygroscopic and degrades in the presence of water |
| Phosphate buffered saline tablets | Fisher Scientific | BP2944 | Keep dry |
| Alginic acid, sodium salt | Acros Organics | 177775000 | Use heat to aid in dissolving |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientific | C79 | |
| Canola oil | Local store | Obtain from a local store | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | 93773 | |
| 70% (v/v) Isopropoanol | Fisher Scientific | A416-4 | |
| Porcine ears | Haine's Pork Shop | Obtain from a local butcher | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Human embryonic kidney 293 cells | ATCC | ATCC CRL-1573 | Store in liquid nitrogen for long-term use |
| DMEM: 1X, high glucose, no pyruvate | Life Technologies | 11965126 | Refrigerate |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10082-147 | Refrigerate |
| Penn Strep: 10,000 U/ml | Life Technologies | 15140-122 | Refrigerate |
| Trypsin-EDTA: 0.5%, 10X | Life Technologies | 15400-054 | Refrigerate |
| Methanol | VWR | AAA44571-K7 | |
| Live/Dead Cell viability kit | Life Technologies | L3224 | Light sensitive, keep frozen |
| XTT cell viability kit | Sigma Aldrich | TOX2-1KT | Light sensitive, keep frozen |
| Clear DMEM: 1X, high glucose, no phenol | Life Technologies | 21063-029 | Refrigerate |
| Dulbecco's PBS: 1X | Life Technologies | 14190136 | Refrigerate |
| Sodium citrate | EMD | SX0445-1 | |
| Positive displacement pipette | BrandTech Scientific, INC | 2702904 | Dispenses 100 – 500 µL and comes with attachable tips |
| No 3. Stainless Steel scalpel handle | Sigma Aldrich | S2896 | |
| Miltex sterile surgical blades | Fisher Scientific | 12-460-440 | Size 10 |
| Power gem homogenizer | Fisher Scientific | 08-451-660 | Model # 125 |
| Porcelain mortar and pestle | Sigma Aldrich | Z247464 | Holds 50 mL |
| FreeZone 1 L benchtop freeze dry system | Labconco | 7740020 | Freeze samples prior to use |
| Oil sealed rotary vane pump | Edwards | A65301906 | Model # RV5 |
| Incubating orbital shaker | VWR | 12620-946 | Model # 980153 |
| Benchtop refrigerated centrifuge | Forma Scientific, INC | Model # 5682 | |
| Heated ovens | VWR | Model # 1235PC | |
| 2 N force gauge | Shimpo | FGV-0.5XY | Model # FGV-0.5XY |
| E-force test stand | Shimpo | FGS-200PV | Model # FGS-200PV |
| Tissue culture swinging bucket centrifuge | Beckman Coulter | 366830 | Model #6S-6KR |
| Tissue culture microcentrifuge | Eppendorf | Model #5415C | |
| Hemacytometer set | Hausser Scientific | 3720 | Requires replacement cover glass slips |
| Slide warmer | Lab Scientific | XH-2022 | Model # XH-2002 |
| Portable heating lamp | Underwriters Laboratories | Helps to maintain polymer temperature at 37°C | |
| Inverted fluorescent microscope | Zeiss | Model Axiovert 25 CFL | |
| Heated water bath | VWR | Model # 1235PC | |
| Rocking platform | VWR | Series 100 | |
| Multiskan FC microtiter plate reader | Thermo Scientific | Type 357 | |
| Cell culture incubator | VWR | Model # 2350T | |
| Purifier class II biosafety cabinet | Labconco | Delta Series |
Referências
- Bidarra, S.J., Barrias, C.C., & Granja, P.L. Injectable alginate hydrogels for cell delivery in tissue engineering. Acta Biomater. 10, 1646-1662 (2014).
- Choi, J. et al. Human extracellular matrix (ECM) powders for injectable cell delivery and adipose tissue engineering. J. Control. Release. 139, 2-7 (2009).
- Selvam, S., Pithapuram, M.V., Victor, S.P., & Muthu, J. Injectable in situ. forming xylitol-PEG-based hydrogels for cell encapsulation and delivery. Colloid Surface B. 126, 35-43 (2015).
- Park, K.M., Lee, S.Y., Joung, Y.K., Na, J.S., Lee, M.C., & Park, K.D. Thermosensitive chitosan-pluronic hydrogel as an injectable cell delivery carrier for cartilage regeneration. Acta Biomater. 5., 1956-1965 (2009).
- Ren, K., He, C., Xiao, C., Li, G., & Chen, X. Injectable glycopolypeptide hydrogels as biomimetic scaffolds for cartilage tissue engineering. Biomaterials. 51, 238-249 (2015).
- Chiu, Y.L., et al. pH-triggered injectable hydrogels prepared from aqueous N-palmitoyl chitosan: In vitro. characteristics and in vivo. biocompatibility. Biomaterials. 30, 4877-4888 (2009).
- Shim, W.S., et al. pH- and temperature-sensitive, injectable, biodegradable block copolymer hydrogels as carriers for paclitaxel. Int. J. Pharm. 331, 11-18 (2007).
- Singh, N.K., & Lee, D.S. In situ. gelling pH- and temperature-sensitive biodegradable block copolymer hydrogels for drug delivery. J. Control. Release. 193, 214-227 (2014).
- Wang, B., Zhu, W., Zhang, Y., Yang, Z., & Ding, J. Synthesis of a chemically-crosslinked thermo-sensitive hydrogel film and in situ encapsulation of model protein drugs. React. Funct. Polym. 66, 509-518 (2006).
- Zhu, W., & Ding, J. Synthesis and characterization of a redox-initiated, injectable, biodegradable hydrogel. J. Appl. Polym. Sci. 99, 2375-2383 (2006).
- Zan, J., Chen, H., Jiang, G., Lin, Y., & Ding, F. Preparation and properties of crosslinked chitosan thermosensitive hydrogel for injectable drug delivery systems. J. Appl. Polym. Sci. 101, 1892-1898 (2006).
- Togawa, D., Bauer, T.W., Lieberman, I.H., & Takikawa, S. Histologic evaluation of human vertebral bodies after vertebral augmentation with polymethyl methacrylate. Spine. 28, 1521-1527 (2003).
- Berman, A.T., Reid, J.S., Yanicko, D.R., Sih, G.C., & Zimmerman, M.R. Thermally induced bone necrosis in rabbits: relation to implant failure in humans. Clin. Orthop. Relat. R. 186, 284-292 (1984).
- Kretlow, J.D., Klouda, L., & Mikos, A.G. Injectable matrices and scaffolds for drug delivery in tissue engineering. Adv Drug. Deliver. Rev. 59, 263-273 (2007).
- Ye, F., Yaghmur, A., Jensen, H., Larsen, S.W., Larsen, C., & Ostergaard, J. Real-time UV imaging of drug diffusion and release from Pluronic F127 hydrogels. Eur. J. Pharm. Sci. 43, 236-243 (2011).
- Akash, M.S., & Rehman, K. Recent progress in biomedical applications of pluronic (PF127): Pharmaceutical perspectives. J. Control Release. 209, 120-138 (2015).
- Sellers, D.L., Kim, T.H., Mount, C.W., Pun, S.H., & Horner, P.J. Poly(lactic-co-glycolic) acid microspheres encapsulated in Pluronic F-127 prolong hirudin delivery and improve functional recovery from a demyelination lesion. Biomaterials. 35, 8895-8902 (2014).
- Jung, H., Park, K., & Han, D.K. Preparation of TGF-β1-conjugated biodegradable pluronic F127 hydrogel and its application with adipose-derived stem cells. J. Control. Release. 147, 84-91 (2010).
- Lee, S.Y., & Tae, G. Formulation and in vitro characterization of an in situ gelable, photo-polymerizable pluronic hydrogel suitable for injection. J. Control. Release. 119, 313-319 (2007).
- Chen, Y.Y., Wu, H.C., Sun, J.S., Dong, G.C., & Wang, T.W. Injectable and thermoresponsive self-assembled nanocomposite hydrogel for long-term anticancer drug delivery. Langmuir. 19, 3721-3729 (2013).
- Cellesi, F., Tirelli, N., & Hubbell, J.A. Materials for cell encapsulation via a new tandem approach combining reverse thermal gelation and covalent crosslinking. Macromol. Chem. Physic. 203, 1466-1472 (2002).
- Cellesi, F., Tirelli, N., & Hubbell, J.A. Towards a fully-synthetic substitute of alginate: development of a new process using thermal gelation and chemical cross-linking. Biomaterials. 25, 5115-5124 (2004).
- Hirokawa, Y., & Tanaka, T. Volume phase transition in a nonionic gel. J. Chem. Phys. 81, 6379-6380 (1984).
- Freitas, R., & Cussler, E.L. Temperature sensitive gels as extraction solvents. Chem. Eng. Sci. 42, 97-103 (1987).
- Schild, H., & Tirrel, D.A. Microcalorimetric detection of lower critical solution temperatures in aqueous polymer solutions. J. Chem. Phys. 94, 4352-4356 (1990).
- Yagi, Y., Inomata, H., & Saito, S. Solubility parameter of an N-isopropylacrylamide gel. Macromol. 25, 2997-2998 (1992).
- Illmain, F., Tanaka, T., & Kokufuta, E. Volume transition in a gel driven by hydrogen bonding. Nature. 349, 400-401 (1990).
- Vernengo, J., Fussell, G.W., Smith, N.G., & Lowman, A.M. Evaluation of novel injectable hydrogels for nucleus pulposus replacement. J. Biomed. Mater. Res. B. 84, 64-69 (2008).
- Wiltsey, C., et al. Characterization of injectable hydrogels based on poly(N-isopropylacrylamide)-g-chondroitin sulfate with adhesive properties for nucleus pulposus tissue engineering. J. Mater. Sci-Mater. M. 24, 837-847 (2013).
- Ronca, F., Palmieri, L., Panicucci, P., & Ronca G. Anti-inflammatory activity of chondroitin sulfate. Osteoarthr. Cart. 6, 14-21 (1998).
- Pipitone, V. Chondroprotection with chondroitin sulfate. Drug. Exp. Clin. Res. 17, 3-7 (1991).
- Moss, M., Kruger, G.O., & Reynolds, D.C. The effect of chondroitin sulfate on bone healing. Oral Surg. Oral Med. O. 20, 795-801 (1965).
- Nerurkar, N., Elliott, D.M., & Mauck, R.L. Mechanical design criteria fo intervertebral disc tissue engineering. J. Biomech. 43, 1017-1030 (2010).
- Wiltsey, C., et al. Thermogelling bioadhesive scaffolds for intervertebral disk tissue engineering: Preliminary in vitro comparison of aldehyde-based versus alginate microparticle-mediated adhesion. Acta Biomater. 16, 71-80 (2015).
- Xia, Y., Yin, X., Burke, N., & Stover, H. Thermal response of narrow-disperse poly(N-isopropylacrylamide) prepared by atom transfer radical polymerization. Macromol. 38, 5937-5943 (2005).
- Liu, Q., Zhang, P., Qing, A., Lan, Y., & Lu, M. Poly(N-isopropylacrylamide) hydrogels with improved shrinking kinetics by RAFT polymerization. Polymer. 47, 2330-2336 (2006).
- Lemoine, D., Wauters, F., Bouchend'homme, S., & Preat, V. Preparation and characterization of alginate microspheres containing a model antigen. Int. J. Pharm. 176, 9-19 (1998).
- Dang, T.D., & Joo, S.W. Preparation of tadpole-shaped calcium alginate microparticles with sphericity control. Colloid. Surface. B. 102, 766-771 (2013).
- Moebus, K., Siepmann, J., & Bodmeier, R. Novel preparation techniques for alginate-polaxamer microparticles controlling protein release on mucosal surfaces. Eur. J. Pharm. Sci. 45, 358-366 (2012).
- Lih, E., Lee, J.S., Park, K.M., Park, & K.D. Rapidly curable chitosan-PEG hydrogels as tissue adhesives for hemostasis and wound healing. Acta Biomater. 8, 3261-3269 (2012).
- Urban, J., & Maroudas, A. Swelling of the intervertebral disc in vitro. Connect. Tissue Res. 9, 1-10 (1981).
- Ma, H.L., Hung, S.C., Lin, S.Y., Chen, Y.L., & Lo, W.H., Chondrogenesis of human mesenchymal stem cells encapsulated in alginate beads. J. Biomed. Mater. Res. A. 64, 273-281 (2003).
- Leslie, S.K., et al. Controlled release of rat adipose-derived stem cells from alginate microbeads. Biomaterials. 34, 8172-8184 (2013).
- Peroglio, M., Eglin, D., Benneker, L.M., Alini, M., & Grad, S. Thermoreversible hyaluronan-based hydrogel supports in vitro. and ex vivo. disc-like differentiation of human mesenchymal stem cells. Spine J. 13, 1627-1639 (2013).
- Chen, J.P., & Cheng, T.H. Thermo-responsive chitosan-graft-poly(N-isopropylacrylamide) injectable hydrogel for cultivation of chondrocytes and meniscus cells. Macromol. Biosci. 6, 1026-1039 (2006).
- Schoichet, M.S., Li, R.H., White, M.L., & Winn, S.R. Stability of hydrogels used in cell encapsulation: an in vitro. comparison of alginate and agarose. Biotechnol. Bioeng. 50, 374-381 (1996).
- Dai, J., Wang, H., Liu, G., Xu, Z., Li, F., & Fang, H. Dynamic compression and co-culture with nucleus pulposus cells promotes proliferation and differentiation of adipose-derived mesenchymal stem cells. J. Biomech. 47, 966-972 (2014).
- Feng, G., et al. Effects of hypoxias and scaffold architecture on rabbit mesenchymal stem cell differentiation towards a nucleus pulposus-like phenotype. Biomaterials. 32, 8182-8189 (2011).
- Feng, G., et al. Hypoxia differentially regulates human nucleus pulposus and annulus fibrosus cell extracellular matrix production in 3D scaffolds. Osteoarth. Cartilage. 21, 582-588 (2013).
