Transcriptome Profilering van<em> In-Vivo</em> Geproduceerd Bovine Pre-implantatie embryo's met behulp van twee-kleuren Microarray Platform
Summary
Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcripts on a genome-wide basis. Therefore, this protocol provides an optimized technical procedure in a two-color custom made bovine array using Day 7 bovine embryos to demonstrate the feasibility of using low amount of total RNA.
Abstract
Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo development due to their similar developmental process. Although genetic factors are known to affect early embryonic development, the discovery of such factors has been a serious challenge. Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. One of the main decisions that have to be made when planning a microarray experiment is whether to use a one- or two-color approach. Two-color design increases technical replication, minimizes variability, improves sensitivity and accuracy as well as allows having loop designs, defining the common reference samples. Although microarray is a powerful biological tool, there are potential pitfalls that can attenuate its power. Hence, in this technical paper we demonstrate an optimized protocol for RNA extraction, amplification, labeling, hybridization of the labeled amplified RNA to the array, array scanning and data analysis using the two-color analysis strategy.
Introduction
Vroeg embryonaal verlies in hoogproductieve melkkoeien is een van de belangrijkste uitdagingen in de zuivelindustrie 1, 2. Bovine is uitgegroeid tot een interessant model voor pre-implantatie embryo-ontwikkeling van het menselijk studeren omdat ze gelijkaardige ontwikkelingsproces 3, 4. Er is echter meer onderzoek nodig om beter inzicht te krijgen over de genen die betrokken zijn bij runderen vroege embryonale ontwikkeling.
Na twintig jaar sinds de eerste microarray technologie ontwikkeld in 1995 5, de ontwikkeling van verfijndere probe fabricagetechnologie verminderd drukfouten en variabiliteit van de array chips binnen en tussen verschillende microarray platforms 6. Verbeterde microarray technologie geleid tot een wijd toepassing van deze technologie in klinisch onderzoek 7 en meer recent, in vroege embryo quality assessment 8.
De grote hoeveelheid benodigde materiaal voor de microarray technologie is de belangrijkste reden waarom de microarray technologie in eerste instantie niet aan een aantal onderzoeksgebieden in te voeren, zoals de vroege embryonale ontwikkeling. Meer recent zijn RNA amplificatiewerkwijzen verbeterd lineair amplificeren van RNA tot microgram niveau van sub-nanogram vanaf RNA materiaal 9. Er zijn verschillende commerciële RNA amplificatie kits op de markt; Echter, hoe meer populair goed ontwikkeld kits soortgelijk aan Ribo-Single Primer isothermische amplificatie 10 en T7-promoter gedreven 11 methoden. De meest populaire antisense RNA-amplificatie gebruikt in vitro transcriptie met oligo dT primer koppelen aan een T7 promoter 5 'einde 12. Deze technologie maakt het handhaven van de meest representatieve anti-sense transcripten na lineaire versterking fof hybridisatie arrays 13. Deze werkwijze is aangepast aan picogram niveau van totaal RNA geëxtraheerd uit runder embryo 8 amplificeren.
Universele verbindingssysteem (ULS) de labelingsmethode die rechtstreeks opgenomen het DNA of RNA geamplificeerd met platina gebonden fluorescerende kleurstof ofwel Cyanine 547 of 647 Cyanine, door vorming van een coördinatieve binding op positie N7 van guanine 14. Deze werkwijze werd aangepast embryo onderzoek stabieler aRNA geamplificeerd ongewijzigd vergeleken met de gemodificeerde aminoallyl ARNA gegenereerd door enzymatische methode 15 te genereren. Zowel single kleurstof en twee kleurstoffen etikettering methoden zijn aangepast met behulp van Universal Linkage System in microarray. Een grote microarray vergelijkingen studie was dat er een goede correlatie datakwaliteit tussen één- en twee-color matrix platforms 6.
Onlangs, zowel T7 promotor rijdenn antisense RNA amplificatie en labeling ULS werkwijzen ontwikkeld om een meer betrouwbare protocol bij een voldoende hoge kwaliteit gemerkt aRNA materialen voor microarray hybridisatie 8, 16 te genereren. Daarom is deze studie geeft een protocol om een aantal van de belangrijke stappen van RNA-extractie tot data-analyse betrokken zijn in twee kleuren microarray met behulp van dag 7 embryo's van runderen als voorbeeld te tonen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het eerste probleem om microarray-analyse uit te voeren met behulp van de Dag 7 embryo's van runderen krijgt niet voldoende hoeveelheden van hoge kwaliteit RNA voor het bestuderen van genexpressie. Traditioneel fenol / chloroform RNA-extractie en ethanolprecipitatie methode wordt niet aanbevolen voor Dag 7 embryo's, wat resulteert in een lage opbrengst en mogelijke overgebleven fenol remmen RNA-amplificatie reactie. In plaats daarvan een standaardmethode kolommen gebaseerde beter om totaal RNA te isoleren en elu…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research supported by Alberta Livestock and Meat Agency, Alberta Innovates – BioSolutions, Alberta Milk, and Livestock Research Branch, Alberta Agriculture and Forestry.
Materials
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | KIT0204 | |
| RNase-Free DNase Set (50) | Qiagen | 79254 | |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| Arcturus RiboAmp HS PLUS Kit | Applied Biosystems | KIT0505 | |
| 2100 Bioanalyzer Instruments | Agilent Technologies | G2940CA | |
| RNA Screen Tape | Agilent Technologies | 5067-5576 | |
| ULS Fluorescent Labeling Kit | Kreatech Diagnostics | EA-021 | |
| Custom Gene Expression Microarrays | Agilent Technologies | G2514F | |
| Agilent Gene Expression wash buffer 1 | Agilent Technologies | Part #5188-5325 | |
| Agilent Gene Expression wash buffer 2 | Agilent Technologies | Part #5188-5326 | |
| 2X Hi-RPM Hybridization buffer | Agilent Technologies | Part #5190-0403 | |
| 25X Fragment buffer | Agilent Technologies | Part #5185-5974 | |
| 10X GE Blocking Agent | Agilent Technologies | Part #5188-5281 | |
| Stabilization and drying solution | Agilent Technologies | Part #5185-5979 | |
| Gasket slides enabled by Agilent SureHyb techonolgy | Agilent Technologies | G2524-60012 | Pack of 20 gasket slides, 4 microarrays/slide |
| Two-Color RNA Spike-In Kit | Agilent Technologies | Cat# 5188-5279 | |
| GenePix 4000B array scanner | Molecular Devices | GENEPIX 4000B-U | |
| Ozone Free Box | BioTray | OFB_100x200 | |
| GAL file | Agilent Technologies | – |
Referências
- Royal, M. D., Smith, R. F., Friggens, N. C. Fertility in dairy cows: bridging the gaps. Animal. 2 (08), 1101-1103 (2008).
- Diskin, M. G., Murphy, J. J., Sreenan, J. M. Embryo survival in dairy cows managed under pastoral conditions. Anim. Reprod. Sci. 96 (3-4), 297-311 (2006).
- Wrenzycki, C., et al. Effects of culture system and protein supplementation on mRNA expression in pre-implantation bovine embryos. Hum. Reprod. 16 (5), 893-901 (2001).
- Menezo, Y. J., Herubel, F. Mouse and bovine models for human IVF. Reprod. Biomed. Online. 4 (2), 170-175 (2002).
- Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science. 270 (5235), 467-470 (1995).
- Patterson, T. A., et al. Performance comparison of one-color and two-color platforms within the MicroArray Quality Control (MAQC) project. Nat. Biotechnol. 24 (9), 1140-1150 (2006).
- Rhodes, D. R., Chinnaiyan, A. M. Integrative analysis of the cancer transcriptome. Nat. Genetics. 37, 31-37 (2005).
- Robert, C., et al. Combining resources to obtain a comprehensive survey of the bovine embryo transcriptome through deep sequencing and microarrays. Mol. Reprod. Dev. 78 (9), 651-664 (2011).
- Nygaard, V., Hovig, E. Options available for profiling small samples: a review of sample amplification technology when combined with microarray profiling. Nucleic Acids Res. 34 (3), 996-1014 (2006).
- Kurn, N., Chen, P., Heath, J. D., Kopf-Sill, A., Stephens, K. M., Wang, S. Novel isothermal, linear nucleic acid amplification systems for highly multiplexed applications. Clin Chem. 51 (10), 1973-1981 (2005).
- Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., Yool, A., Dement, W. C., Barchas, J. D., Eberwine, J. H. Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA. Proc. Natl. Acad. Sci. 87 (5), 1663-1667 (1990).
- Phillips, J., Eberwine, J. H. Antisense RNA Amplification: A linear amplification method for analyzing the mRNA population from single living cells. Methods. 10 (3), 283-288 (1996).
- Gilbert, I., Scantland, S., Dufort, I., Gordynska, O., Labbe, A., Sirard, M. A., Robert, C. Real-time monitoring of aRNA production during T7 amplification to prevent the loss of sample representation during microarray hybridization sample preparation. Nucleic Acids Res. 37 (8), 65 (2009).
- Gijlswijk, R. P., Talman, E. G., Jansse, P. J., Snoeijers, S. S., Killian, J., Tanke, H. J., Heetebrij, R. J. Universal Linkage System: versatile nucleic acid labeling technique. Expert Re. Mol. Diagn. 1 (1), 81-91 (2001).
- Gilbert, I., Scantland, S., Sylvestre, E. L., Dufort, I., Sirard, M. A., Robert, C. Providing a stable methodological basis for comparing transcript abundance of developing embryos using microarrays. Mol. Hum. Reprod. 16 (8), 601-616 (2010).
- Tsoi, S., et al. Development of a porcine (Sus scofa) embryo-specific microarray: array annotation and validation. BMC Genomics. 13, 370 (2012).
- Salehi, R., et al. Superovulatory response and embryo production in Holstein cows fed diets enriched in oleic, linoleic or α-linolenic acid. Reprod. Fertil. Dev. 26 (1), 218-218 (2013).
- Thangavelu, G., Colazo, M. G., Ambrose, D. J., Oba, M., Okine, E. K., Dyck, M. K. Diets enriched in unsaturated fatty acids enhance early embryonic development in lactating Holstein cows. Theriogenology. 68 (7), 949-957 (2007).
- . Agilent 2100 Bioanalyzer User’s Guide Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2946-90004_Vespucci_UG_eBook_(NoSecPack) (2016)
- Kerr, K. F. Extended analysis of benchmark datasets for Agilent two-color microarray. BMC Bioinformatics. 8, 371 (2007).
- Zhu, Q., Miecznikowski, J. C., Halfon, M. S. A wholly defined Agilent microarray spike-in dataset. Bioinformatics. 27 (9), 1284-1289 (2011).
- Vallee, M., Gravel, C., Palin, M. F., Reghenas, H., Stothard, P., Wishart, D. S., Sirard, M. A. Identification of novel and known oocyte-specific genes using complementary DNA subtraction and microarray analysis in three different species. Biol. Reprod. 73 (1), 63-71 (2005).
- Thomas, P. D., et al. PANTHER: a library of protein families and subfamilies indexed by function. Genome Res. 13 (9), 2129-2141 (2003).
- Mi, H., et al. The PANTHER database of protein families, subfamilies, functions and pathways. Nucleic Acids Res. 33, 284-288 (2005).
- Mi, H., Muruganujan, A., Casagrande, J. T., Thomas, P. D. Large-scale gene function analysis with the PANTHER classification system. Nat. Protoc. 8, 1551-1566 (2013).
- Ross, P. J., Wang, K., Kocabas, A., Cibelli, J. B. Housekeeping gene transcript abundance in bovine fertilized and cloned embryos. Cell Reprogram. 12 (6), 709-717 (2010).
- Gilbert, I., et al. The dynamics of gene products fluctuation during bovine pre-hatching development. Mol. Reprod. Dev. 76, 762-772 (2009).
- Vallee, M., et al. Revealing the bovine embryo transcript profiles during early in vivo embryonic development. Reproduction. 138 (1), 95-105 (2009).
- Dafforn, A., et al. Linear mRNA amplification from as little as 5 ng total RNA for global gene expression analysis. Biotechniques. 37 (5), 854-857 (2004).
- Beaujean, N., Jammes, H., Jouneau, A., Dufort, I., Rovert, C., Sirard, M. A. Nuclear Reprogramming. Studying Bovine Early Embryo Transcriptome by Microarray. , (2015).
- Patterson, T. A., et al. Performance comparison of one-color and two-color platforms within the MicroArray Quality Control (MAQC) project. Nat. Biotechnol. 24 (9), 1140-1150 (2006).
