의 사체 프로파일 링<em> 생체</em2 색의 마이크로 어레이 플랫폼을 사용하여> 제작 소 착상 전 배아
Summary
Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcripts on a genome-wide basis. Therefore, this protocol provides an optimized technical procedure in a two-color custom made bovine array using Day 7 bovine embryos to demonstrate the feasibility of using low amount of total RNA.
Abstract
Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo development due to their similar developmental process. Although genetic factors are known to affect early embryonic development, the discovery of such factors has been a serious challenge. Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. One of the main decisions that have to be made when planning a microarray experiment is whether to use a one- or two-color approach. Two-color design increases technical replication, minimizes variability, improves sensitivity and accuracy as well as allows having loop designs, defining the common reference samples. Although microarray is a powerful biological tool, there are potential pitfalls that can attenuate its power. Hence, in this technical paper we demonstrate an optimized protocol for RNA extraction, amplification, labeling, hybridization of the labeled amplified RNA to the array, array scanning and data analysis using the two-color analysis strategy.
Introduction
높은 생산 젖소의 초기 배아 손실은 낙농 산업 1, 2의 주요 과제 중 하나입니다. 소는 그들의 유사한 발달 과정 3, 4 인간의 착상 전 배아 발달을 연구하는 흥미있는 모델이되고있다. 그러나, 더 많은 연구가 소 초기 배아 발달에 관여하는 유전자에 대한 이해가 요구된다.
첫 마이크로 어레이 기술 보낸 이십년 1995 5 개발 후보다 정교한 프로브 제작 기술 감소 인쇄 오류 및 마이크로 어레이 내의 상이한 플랫폼 (6) 사이의 어레이 칩의 변동의 개발. 개선 된 마이크로 어레이 기술은 초기 배아 질문에, 최근 임상 연구 7에서이 기술을 널리 응용 프로그램에서 결과를 uality 평가 (8).
마이크로 어레이 기술에 필요한 재료의 양이 큰 마이크로 어레이 기술은 초기에 초기 배아 발달로 연구 분야의 번호를 입력 못한 주된 이유이다. 최근 RNA 증폭 방법은 선형 RNA 재료 (9)를 시작 서브 나노 그램에서 마이크로 그램 수준까지 RNA를 증폭하도록 개선되었다. 시장에서 사용할 수있는 여러 상업 RNA 증폭 키트가 있습니다; 그러나, 더 많은 인기를 잘 개발 키트는 Ribo를 싱글 프라이머 등온 증폭 (10) 관련 및 T7 프로모터 (11) 방법을 구동된다. 가장 인기있는 안티센스 RNA 증폭는 5 '말단 (12)에 T7 프로모터에 연결하는 올리고 DT 프라이머와 시험 관내 전사에 사용합니다. 이 기술은 선형 증폭 후에 F 대표적인 안티센스 전 사체를 최대한 유지할 수 있도록또는 배열 하이브리드 13. 이 방법은 소 배아 (8)로부터 추출 된 총 RNA의 피코 그램 수준을 증폭하도록하고있다.
유니버설 링크 시스템 (ULS)를 직접 구아닌 (14)의 N7 위치에 배위 결합을 형성함으로써, 백금 결합 된 형광 염료 중 하나 시아닌 (547) 또는 시아닌 647로 DNA 또는 RNA 증폭을 통합 라벨링 방법입니다. 이 방법은 ARNA이 효소 방법 (15)에 의해 생성 된 수정 된 아미노 알릴에 비해 수정하지 않고 ARNA 증폭보다 안정적인 생성하는 배아 연구에 적응했다. 단일 염료와 두 개의 염료 라벨 두 가지 방법은 마이크로 어레이에 범용 연계 시스템을 사용하여 적용하고있다. 큰 마이크로 어레이의 비교 연구는 단일 및 두 개 컬러 배열 플랫폼 (6) 사이의 데이터 품질의 상관 관계가 있다고 하였다.
최근 두 T7 프로모터 드라이브N 안티센스 RNA 증폭 ULS 라벨링 방법은 마이크로 어레이 혼성화 8 16 아르나 물질을 표지 고품질의 충분한 양을 생성하기위한 더 신뢰성있는 프로토콜을 제공하기 위해 개발되었다. 따라서 본 연구는 예를 들어 7 일 소 배아를 사용하여 두 개의 색상에 관련된 마이크로 어레이 데이터 분석 RNA 추출의 중요한 단계 중 일부를 입증하는 프로토콜을 제공한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
첫 번째 문제는 유전자 발현 연구를위한 고품질의 RNA의 충분한 양을 받고 있지 않은 7 일 소 배아를 이용한 마이크로 어레이 분석을 수행한다. 기존의 페놀 / 클로로포름 RNA 추출 및 에탄올 침전 방법은 낮은 수율 및 RNA 증폭 반응 억제 할 수 남은 페놀의 결과로, 7 일 배아를 사용하지 않는 것이 좋습니다. 대신에, 기준 열 기초 방법은 총 RNA를 분리 한 후 농도를 높이기 위해 최소 용출 버퍼로 RNA를 …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research supported by Alberta Livestock and Meat Agency, Alberta Innovates – BioSolutions, Alberta Milk, and Livestock Research Branch, Alberta Agriculture and Forestry.
Materials
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | KIT0204 | |
| RNase-Free DNase Set (50) | Qiagen | 79254 | |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| Arcturus RiboAmp HS PLUS Kit | Applied Biosystems | KIT0505 | |
| 2100 Bioanalyzer Instruments | Agilent Technologies | G2940CA | |
| RNA Screen Tape | Agilent Technologies | 5067-5576 | |
| ULS Fluorescent Labeling Kit | Kreatech Diagnostics | EA-021 | |
| Custom Gene Expression Microarrays | Agilent Technologies | G2514F | |
| Agilent Gene Expression wash buffer 1 | Agilent Technologies | Part #5188-5325 | |
| Agilent Gene Expression wash buffer 2 | Agilent Technologies | Part #5188-5326 | |
| 2X Hi-RPM Hybridization buffer | Agilent Technologies | Part #5190-0403 | |
| 25X Fragment buffer | Agilent Technologies | Part #5185-5974 | |
| 10X GE Blocking Agent | Agilent Technologies | Part #5188-5281 | |
| Stabilization and drying solution | Agilent Technologies | Part #5185-5979 | |
| Gasket slides enabled by Agilent SureHyb techonolgy | Agilent Technologies | G2524-60012 | Pack of 20 gasket slides, 4 microarrays/slide |
| Two-Color RNA Spike-In Kit | Agilent Technologies | Cat# 5188-5279 | |
| GenePix 4000B array scanner | Molecular Devices | GENEPIX 4000B-U | |
| Ozone Free Box | BioTray | OFB_100x200 | |
| GAL file | Agilent Technologies | – |
Referências
- Royal, M. D., Smith, R. F., Friggens, N. C. Fertility in dairy cows: bridging the gaps. Animal. 2 (08), 1101-1103 (2008).
- Diskin, M. G., Murphy, J. J., Sreenan, J. M. Embryo survival in dairy cows managed under pastoral conditions. Anim. Reprod. Sci. 96 (3-4), 297-311 (2006).
- Wrenzycki, C., et al. Effects of culture system and protein supplementation on mRNA expression in pre-implantation bovine embryos. Hum. Reprod. 16 (5), 893-901 (2001).
- Menezo, Y. J., Herubel, F. Mouse and bovine models for human IVF. Reprod. Biomed. Online. 4 (2), 170-175 (2002).
- Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science. 270 (5235), 467-470 (1995).
- Patterson, T. A., et al. Performance comparison of one-color and two-color platforms within the MicroArray Quality Control (MAQC) project. Nat. Biotechnol. 24 (9), 1140-1150 (2006).
- Rhodes, D. R., Chinnaiyan, A. M. Integrative analysis of the cancer transcriptome. Nat. Genetics. 37, 31-37 (2005).
- Robert, C., et al. Combining resources to obtain a comprehensive survey of the bovine embryo transcriptome through deep sequencing and microarrays. Mol. Reprod. Dev. 78 (9), 651-664 (2011).
- Nygaard, V., Hovig, E. Options available for profiling small samples: a review of sample amplification technology when combined with microarray profiling. Nucleic Acids Res. 34 (3), 996-1014 (2006).
- Kurn, N., Chen, P., Heath, J. D., Kopf-Sill, A., Stephens, K. M., Wang, S. Novel isothermal, linear nucleic acid amplification systems for highly multiplexed applications. Clin Chem. 51 (10), 1973-1981 (2005).
- Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., Yool, A., Dement, W. C., Barchas, J. D., Eberwine, J. H. Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA. Proc. Natl. Acad. Sci. 87 (5), 1663-1667 (1990).
- Phillips, J., Eberwine, J. H. Antisense RNA Amplification: A linear amplification method for analyzing the mRNA population from single living cells. Methods. 10 (3), 283-288 (1996).
- Gilbert, I., Scantland, S., Dufort, I., Gordynska, O., Labbe, A., Sirard, M. A., Robert, C. Real-time monitoring of aRNA production during T7 amplification to prevent the loss of sample representation during microarray hybridization sample preparation. Nucleic Acids Res. 37 (8), 65 (2009).
- Gijlswijk, R. P., Talman, E. G., Jansse, P. J., Snoeijers, S. S., Killian, J., Tanke, H. J., Heetebrij, R. J. Universal Linkage System: versatile nucleic acid labeling technique. Expert Re. Mol. Diagn. 1 (1), 81-91 (2001).
- Gilbert, I., Scantland, S., Sylvestre, E. L., Dufort, I., Sirard, M. A., Robert, C. Providing a stable methodological basis for comparing transcript abundance of developing embryos using microarrays. Mol. Hum. Reprod. 16 (8), 601-616 (2010).
- Tsoi, S., et al. Development of a porcine (Sus scofa) embryo-specific microarray: array annotation and validation. BMC Genomics. 13, 370 (2012).
- Salehi, R., et al. Superovulatory response and embryo production in Holstein cows fed diets enriched in oleic, linoleic or α-linolenic acid. Reprod. Fertil. Dev. 26 (1), 218-218 (2013).
- Thangavelu, G., Colazo, M. G., Ambrose, D. J., Oba, M., Okine, E. K., Dyck, M. K. Diets enriched in unsaturated fatty acids enhance early embryonic development in lactating Holstein cows. Theriogenology. 68 (7), 949-957 (2007).
- . Agilent 2100 Bioanalyzer User’s Guide Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2946-90004_Vespucci_UG_eBook_(NoSecPack) (2016)
- Kerr, K. F. Extended analysis of benchmark datasets for Agilent two-color microarray. BMC Bioinformatics. 8, 371 (2007).
- Zhu, Q., Miecznikowski, J. C., Halfon, M. S. A wholly defined Agilent microarray spike-in dataset. Bioinformatics. 27 (9), 1284-1289 (2011).
- Vallee, M., Gravel, C., Palin, M. F., Reghenas, H., Stothard, P., Wishart, D. S., Sirard, M. A. Identification of novel and known oocyte-specific genes using complementary DNA subtraction and microarray analysis in three different species. Biol. Reprod. 73 (1), 63-71 (2005).
- Thomas, P. D., et al. PANTHER: a library of protein families and subfamilies indexed by function. Genome Res. 13 (9), 2129-2141 (2003).
- Mi, H., et al. The PANTHER database of protein families, subfamilies, functions and pathways. Nucleic Acids Res. 33, 284-288 (2005).
- Mi, H., Muruganujan, A., Casagrande, J. T., Thomas, P. D. Large-scale gene function analysis with the PANTHER classification system. Nat. Protoc. 8, 1551-1566 (2013).
- Ross, P. J., Wang, K., Kocabas, A., Cibelli, J. B. Housekeeping gene transcript abundance in bovine fertilized and cloned embryos. Cell Reprogram. 12 (6), 709-717 (2010).
- Gilbert, I., et al. The dynamics of gene products fluctuation during bovine pre-hatching development. Mol. Reprod. Dev. 76, 762-772 (2009).
- Vallee, M., et al. Revealing the bovine embryo transcript profiles during early in vivo embryonic development. Reproduction. 138 (1), 95-105 (2009).
- Dafforn, A., et al. Linear mRNA amplification from as little as 5 ng total RNA for global gene expression analysis. Biotechniques. 37 (5), 854-857 (2004).
- Beaujean, N., Jammes, H., Jouneau, A., Dufort, I., Rovert, C., Sirard, M. A. Nuclear Reprogramming. Studying Bovine Early Embryo Transcriptome by Microarray. , (2015).
- Patterson, T. A., et al. Performance comparison of one-color and two-color platforms within the MicroArray Quality Control (MAQC) project. Nat. Biotechnol. 24 (9), 1140-1150 (2006).
