Транскриптом профилирование<em> In-Vivo</em> Производимые Бычьи Эмбрионы предимплантационной Использование Двухцветный Microarray платформы
Summary
Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcripts on a genome-wide basis. Therefore, this protocol provides an optimized technical procedure in a two-color custom made bovine array using Day 7 bovine embryos to demonstrate the feasibility of using low amount of total RNA.
Abstract
Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo development due to their similar developmental process. Although genetic factors are known to affect early embryonic development, the discovery of such factors has been a serious challenge. Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. One of the main decisions that have to be made when planning a microarray experiment is whether to use a one- or two-color approach. Two-color design increases technical replication, minimizes variability, improves sensitivity and accuracy as well as allows having loop designs, defining the common reference samples. Although microarray is a powerful biological tool, there are potential pitfalls that can attenuate its power. Hence, in this technical paper we demonstrate an optimized protocol for RNA extraction, amplification, labeling, hybridization of the labeled amplified RNA to the array, array scanning and data analysis using the two-color analysis strategy.
Introduction
Ранняя эмбриональная потеря в высокопродуктивных молочных коров является одной из основных проблем в молочной промышленности 1, 2. Бычий стала интересной моделью для изучения развития предимплантационной эмбрионов человека из – за их подобного процесса развития 3, 4. Тем не менее, требуются дальнейшие исследования, чтобы иметь лучшее представление о генах, участвующих в коровьем раннего эмбрионального развития.
Через двадцать лет после первой технологии микрочипов разработан в 1995 году 5, разработка более совершенных технологий изготовления зонда уменьшенных ошибок и изменчивости чипов массива внутри , так и между различными микрочипов платформ 6 печати. Усовершенствованная технология микрочипов привело к широко применения этой технологии в области клинических исследований 7 и совсем недавно, в начале эмбриона дОценка uality 8.
Большое количество необходимого материала для микрочипов технологии является основной причиной, почему технология микрочипов изначально не удалось ввести ряд научно-исследовательских областях, таких, как раннее эмбриональное развитие. Совсем недавно, методы амплификации РНК были улучшены линейно усиливать РНК до уровня микрограммов из суб-нанограмм исходного материала РНК 9. Есть несколько коммерческих наборов РНК амплификации на рынке; Тем не менее, более популярные хорошо разработанные комплекты связаны с Рибо-Single Праймер изотермическом Amplification 10 и T7 промотор приводом 11 методов. Самой популярной антисмысловых РНК амплификации использует в пробирке транскрипции с олиго – дТ праймера , соединяющего с Т7 промотора на 5 'конце 12. Эта технология позволяет поддерживать наиболее представительных антисмысловых транскриптов после линейного усиления Fили массивы гибридизация 13. Этот метод был адаптирован для усиления пикограммов уровня тотальной РНК , выделенной из бычьего эмбриона 8.
Универсальная система Рычажный (ULS) является метод маркировки , который непосредственно включает ДНК или РНК , амплифицированной с платиной-сшитый флуоресцентного красителя либо цианиновыми 547 или цианиновыми 647, путем формирования координационную связь на N7 положении гуанина 14. Этот метод был адаптирован в исследовании эмбрионов для создания более стабильной усиливается Арна без изменений по сравнению с aminoallyl модифицированным Арна , порожденного ферментативным способом 15. Оба одного красителя и маркировки два красители методы были адаптированы с помощью универсальной системы Linkage в микрочипе. Большое исследование микрочипов сравнения в том , что существует хорошая корреляция качества данных между одно- и двухцветных массива платформ 6.
В последнее время, как Т7 промотор приводаN антисмысловой РНК амплификации и мечения ULS методы были разработаны , чтобы обеспечить более надежный протокол для создания достаточного количества высококачественных меченый ARNA материалов для микрочипов гибридизации 8, 16. Таким образом, данное исследование обеспечивает протокол, чтобы продемонстрировать некоторые из важных этапов от экстракции РНК к анализу данных, участвующих в двухцветной микрочипов с использованием 7-й день эмбрионы крупного рогатого скота в качестве примера.
Protocol
Representative Results
Discussion
Первая проблема, для выполнения анализа микрочипов с использованием 7-й день эмбрионы крупного рогатого скота не получает достаточного количества РНК высокой качества для изучения экспрессии генов. Выделение РНК Традиционная фенол / хлороформ и способ осаждения этанолом не рекоменду…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research supported by Alberta Livestock and Meat Agency, Alberta Innovates – BioSolutions, Alberta Milk, and Livestock Research Branch, Alberta Agriculture and Forestry.
Materials
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | KIT0204 | |
| RNase-Free DNase Set (50) | Qiagen | 79254 | |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| Arcturus RiboAmp HS PLUS Kit | Applied Biosystems | KIT0505 | |
| 2100 Bioanalyzer Instruments | Agilent Technologies | G2940CA | |
| RNA Screen Tape | Agilent Technologies | 5067-5576 | |
| ULS Fluorescent Labeling Kit | Kreatech Diagnostics | EA-021 | |
| Custom Gene Expression Microarrays | Agilent Technologies | G2514F | |
| Agilent Gene Expression wash buffer 1 | Agilent Technologies | Part #5188-5325 | |
| Agilent Gene Expression wash buffer 2 | Agilent Technologies | Part #5188-5326 | |
| 2X Hi-RPM Hybridization buffer | Agilent Technologies | Part #5190-0403 | |
| 25X Fragment buffer | Agilent Technologies | Part #5185-5974 | |
| 10X GE Blocking Agent | Agilent Technologies | Part #5188-5281 | |
| Stabilization and drying solution | Agilent Technologies | Part #5185-5979 | |
| Gasket slides enabled by Agilent SureHyb techonolgy | Agilent Technologies | G2524-60012 | Pack of 20 gasket slides, 4 microarrays/slide |
| Two-Color RNA Spike-In Kit | Agilent Technologies | Cat# 5188-5279 | |
| GenePix 4000B array scanner | Molecular Devices | GENEPIX 4000B-U | |
| Ozone Free Box | BioTray | OFB_100x200 | |
| GAL file | Agilent Technologies | – |
Referências
- Royal, M. D., Smith, R. F., Friggens, N. C. Fertility in dairy cows: bridging the gaps. Animal. 2 (08), 1101-1103 (2008).
- Diskin, M. G., Murphy, J. J., Sreenan, J. M. Embryo survival in dairy cows managed under pastoral conditions. Anim. Reprod. Sci. 96 (3-4), 297-311 (2006).
- Wrenzycki, C., et al. Effects of culture system and protein supplementation on mRNA expression in pre-implantation bovine embryos. Hum. Reprod. 16 (5), 893-901 (2001).
- Menezo, Y. J., Herubel, F. Mouse and bovine models for human IVF. Reprod. Biomed. Online. 4 (2), 170-175 (2002).
- Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science. 270 (5235), 467-470 (1995).
- Patterson, T. A., et al. Performance comparison of one-color and two-color platforms within the MicroArray Quality Control (MAQC) project. Nat. Biotechnol. 24 (9), 1140-1150 (2006).
- Rhodes, D. R., Chinnaiyan, A. M. Integrative analysis of the cancer transcriptome. Nat. Genetics. 37, 31-37 (2005).
- Robert, C., et al. Combining resources to obtain a comprehensive survey of the bovine embryo transcriptome through deep sequencing and microarrays. Mol. Reprod. Dev. 78 (9), 651-664 (2011).
- Nygaard, V., Hovig, E. Options available for profiling small samples: a review of sample amplification technology when combined with microarray profiling. Nucleic Acids Res. 34 (3), 996-1014 (2006).
- Kurn, N., Chen, P., Heath, J. D., Kopf-Sill, A., Stephens, K. M., Wang, S. Novel isothermal, linear nucleic acid amplification systems for highly multiplexed applications. Clin Chem. 51 (10), 1973-1981 (2005).
- Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., Yool, A., Dement, W. C., Barchas, J. D., Eberwine, J. H. Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA. Proc. Natl. Acad. Sci. 87 (5), 1663-1667 (1990).
- Phillips, J., Eberwine, J. H. Antisense RNA Amplification: A linear amplification method for analyzing the mRNA population from single living cells. Methods. 10 (3), 283-288 (1996).
- Gilbert, I., Scantland, S., Dufort, I., Gordynska, O., Labbe, A., Sirard, M. A., Robert, C. Real-time monitoring of aRNA production during T7 amplification to prevent the loss of sample representation during microarray hybridization sample preparation. Nucleic Acids Res. 37 (8), 65 (2009).
- Gijlswijk, R. P., Talman, E. G., Jansse, P. J., Snoeijers, S. S., Killian, J., Tanke, H. J., Heetebrij, R. J. Universal Linkage System: versatile nucleic acid labeling technique. Expert Re. Mol. Diagn. 1 (1), 81-91 (2001).
- Gilbert, I., Scantland, S., Sylvestre, E. L., Dufort, I., Sirard, M. A., Robert, C. Providing a stable methodological basis for comparing transcript abundance of developing embryos using microarrays. Mol. Hum. Reprod. 16 (8), 601-616 (2010).
- Tsoi, S., et al. Development of a porcine (Sus scofa) embryo-specific microarray: array annotation and validation. BMC Genomics. 13, 370 (2012).
- Salehi, R., et al. Superovulatory response and embryo production in Holstein cows fed diets enriched in oleic, linoleic or α-linolenic acid. Reprod. Fertil. Dev. 26 (1), 218-218 (2013).
- Thangavelu, G., Colazo, M. G., Ambrose, D. J., Oba, M., Okine, E. K., Dyck, M. K. Diets enriched in unsaturated fatty acids enhance early embryonic development in lactating Holstein cows. Theriogenology. 68 (7), 949-957 (2007).
- . Agilent 2100 Bioanalyzer User’s Guide Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2946-90004_Vespucci_UG_eBook_(NoSecPack) (2016)
- Kerr, K. F. Extended analysis of benchmark datasets for Agilent two-color microarray. BMC Bioinformatics. 8, 371 (2007).
- Zhu, Q., Miecznikowski, J. C., Halfon, M. S. A wholly defined Agilent microarray spike-in dataset. Bioinformatics. 27 (9), 1284-1289 (2011).
- Vallee, M., Gravel, C., Palin, M. F., Reghenas, H., Stothard, P., Wishart, D. S., Sirard, M. A. Identification of novel and known oocyte-specific genes using complementary DNA subtraction and microarray analysis in three different species. Biol. Reprod. 73 (1), 63-71 (2005).
- Thomas, P. D., et al. PANTHER: a library of protein families and subfamilies indexed by function. Genome Res. 13 (9), 2129-2141 (2003).
- Mi, H., et al. The PANTHER database of protein families, subfamilies, functions and pathways. Nucleic Acids Res. 33, 284-288 (2005).
- Mi, H., Muruganujan, A., Casagrande, J. T., Thomas, P. D. Large-scale gene function analysis with the PANTHER classification system. Nat. Protoc. 8, 1551-1566 (2013).
- Ross, P. J., Wang, K., Kocabas, A., Cibelli, J. B. Housekeeping gene transcript abundance in bovine fertilized and cloned embryos. Cell Reprogram. 12 (6), 709-717 (2010).
- Gilbert, I., et al. The dynamics of gene products fluctuation during bovine pre-hatching development. Mol. Reprod. Dev. 76, 762-772 (2009).
- Vallee, M., et al. Revealing the bovine embryo transcript profiles during early in vivo embryonic development. Reproduction. 138 (1), 95-105 (2009).
- Dafforn, A., et al. Linear mRNA amplification from as little as 5 ng total RNA for global gene expression analysis. Biotechniques. 37 (5), 854-857 (2004).
- Beaujean, N., Jammes, H., Jouneau, A., Dufort, I., Rovert, C., Sirard, M. A. Nuclear Reprogramming. Studying Bovine Early Embryo Transcriptome by Microarray. , (2015).
- Patterson, T. A., et al. Performance comparison of one-color and two-color platforms within the MicroArray Quality Control (MAQC) project. Nat. Biotechnol. 24 (9), 1140-1150 (2006).
