Abstract
Malaria inizia quando la fase sporozoite di Plasmodium è inoculata in pelle di un mammifero ospite attraverso una puntura di zanzara. Il parassita altamente mobili non raggiunge solo il fegato per invadere epatociti e la trasformazione in forma eritrociti-infettiva. Si migra anche nella pelle e per il linfonodo drenante prossimale sito di iniezione, dove può essere riconosciuto e degradato da residenti e / o di cellule mieloidi reclutate. L'imaging intravitale ha riferito l'assunzione precoce di fluorescenza brillante Lys-GFP leucociti positivi nella pelle e le interazioni tra sporozoiti e CD11c + cellule del linfonodo drenante. Presentiamo qui una procedura efficiente per recuperare, identificare e contare i sottoinsiemi di cellule mieloidi che vengono reclutati per la pelle del mouse e drenanti linfonodi dopo l'iniezione intradermica di immunizzare dosi di sporozoites in un modello murino. La caratterizzazione fenotipica usando flusso multi-parametrica fornisce citometriaun test affidabile per valutare i primi cambiamenti cellulari dinamiche durante la risposta infiammatoria alle infezioni Plasmodium.
Introduction
La malaria è una delle più letali malattie infettive in tutto il mondo, uccidendo più di mezzo milione di persone all'anno. Infezione da Plasmodium, l'agente causale della malattia, inizia una fase di pre-eritrocitaria (PE). Durante questa fase, sporozoiti iniettati nella pelle ospitante da una femmina anopheline zanzara raggiungono il fegato attraverso il flusso sanguigno e si differenziano epatociti all'interno nelle forme parassiti che infettano i globuli rossi e causano i sintomi della malattia.
Le fasi PE di Plasmodium rappresentano un bersaglio privilegiato per la vaccinazione anti-malaria. In effetti, i vaccini vivi attenuati contro queste fasi, come la radiazione di attenuazione sporozoiti (RAS), parassiti geneticamente arrestati (GAP) o chemioprofilassi e sporozoiti (CPS) hanno dimostrato la loro capacità di proteggere sia roditori e ospiti umani 1-9. Nel modello di roditore, la maggior parte degli studi di vaccinazione sono condotti utilizzando l'immunizzazione per via endovenosa, Che è lo standard in termini di efficacia protettiva. Tuttavia, la descrizione di una fase pelle e l'importanza del linfonodo pelle associata drenante (DLN) nell'elicitazione protezione ha cambiato la nostra percezione della fase PE e sottolineato l'importanza della somministrazione intradermica di iniezione. L'imaging intravitale di P. sporozoiti berghei iniettati nella pelle dei roditori ha dimostrato che solo ~ 25% dell'inoculo raggiunge il fegato attraverso il flusso sanguigno. Il restante 75% ~ distribuisce tra prossimale DLN (~ 15%) e la pelle (~ 50%) 10,11, dove una piccola percentuale può trasformare e rimanere in vita per settimane all'interno delle cellule della pelle 12,13. Inoltre, studi successivi descrivono che l'istituzione di un'efficace immunità protettiva dopo la vaccinazione intradermica avviene principalmente nella pelle-DLN, in cui si attivano specifiche cellule parassita T CD8 +, e solo marginalmente nella milza o del fegato-dLNs 14,15.
Mentrela maggior parte degli studi si sono concentrati sulla caratterizzazione delle cellule effettrici implicati nella creazione di risposta immunitaria protettiva, e tanto meno si sa circa il destino dei parassiti vivi attenuati iniettati nella pelle, in particolare le loro interazioni con il sistema immunitario innato. In particolare, la caratterizzazione di cellule presentanti l'antigene coinvolti nella parassita antigene captazione, l'elaborazione e la presentazione di cellule T CD8 + è di importanza critica, sapendo che l'acquisizione di antigene PE può avvenire sia nella pelle e scomparti DLN. Precedenti studi di imaging intravitale descritto un afflusso iniziale di cellule positive fluorescenza brillante Lys-GFP nella pelle in seguito ad un morso di zanzara infettiva 16 mentre i primi interazioni tra sporozoiti e cellule dendritiche sono stati osservati nel DLN 10,17. Più recentemente, è stato riportato che sporozoiti inoculati nella pelle dalle zanzare aumenta la motilità sia delle cellule T dendritiche e regolamentari nella pelletopi, mentre è stata osservata una serie diminuzione di cellule presentanti l'antigene nel DLN 18.
Si è voluto identificare e quantificare più precisamente i sottoinsiemi di leucociti reclutati nella pelle e corrispondenti DLN nonché coloro che interagiscono con il parassita dopo iniezione intradermica di immunizzare dosi di RAS 19. In questo contesto, abbiamo isolato le cellule mieloidi (CD45 + CD11b +) da entrambi i tessuti e caratterizzato sottopopolazioni di interesse da parte di più = flusso parametrico citometria. Coerentemente con la risposta immunitaria descritto nella fase iniziale della Leishmania importante infezione della pelle 20, la risposta dell'ospite principale per sporozoite iniezione è costituito da una assunzione successiva di neutrofili polimorfonucleati (CD45 + CD11b + Ly6G + Ly6C int) seguita da monociti infiammatorie (CD45 + CD11b + Ly6G - Ly6C +) che sono identificate in base ad DifferentiAl espressione dei marcatori di superficie Ly6G e Ly6C.
Descriviamo qui un protocollo per isolare cellule mieloidi dalla pelle del mouse e DLN dopo l'iniezione intradermica di immunizzare dosi di RAS estratti da infetti ghiandole salivari delle zanzare. iniezioni intradermiche riproducibili e lavorazione dei tessuti sono passi fondamentali per quantificare i cambiamenti fenotipici di infiltrazione popolazione di cellule all'interno dei tessuti infetti. L'approccio seguito dettagliato fornisce un test affidabile per valutare la pelle e la risposta infiammatoria DLN al Plasmodium parassita e può essere esteso a vari sistemi sperimentali.
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Protocol
Tutte le procedure sono state approvate dal comitato dell'Istituto Pasteur e dal Comitato Etico locale sulla sperimentazione animale (comitato etico IDF-Paris 1, Paris, France; numero di contratto: 2.012-0.015) ed eseguite in conformità con le linee guida e regolamenti applicabili.
1. Materiali e reagenti
- Utilizzare femmina Anopheles zanzare stephensi (ceppo Sda500) che si nutrono di topi infetti 3-5 giorni dopo la nascita e posteriore come descritto in precedenza 21.
- Utilizzare i parassiti Plasmodium berghei ANKA clone che esprime il gene Green Fluorescent Protein (GFP) sotto il controllo del costitutiva Heat Shock Protein 70 (HSP70) promotore. Questo produce fluorescenza durante tutto il ciclo di vita del parassita 22.
- topi C57BL / 6JRj uso femminile (7 settimane di età).
Nota: Tutti i reagenti utilizzati nel protocollo descritto sono elencati nella T in grado di Materiali / attrezzature.
- Tra 18-25 giorni dopo il pasto di sangue infetto, raccogliere e freddo anestetizzare le zanzare in una provetta da 15 ml su ghiaccio come descritto in precedenza 21. trasferirli attenzione su un piatto Petri invertendo la provetta. Mantenere gli insetti su ghiaccio ed esporre le zanzare ad una dose 12 krad di γ- o x-irradiazione.
- Isolare sporozoiti attenuati da irradiati ghiandole salivari delle zanzare come descritto in precedenza 21. Raccogliere ghiandole salivari infetti in un piccolo volume (circa 15 ml) di tampone fosfato salina di 1x Dulbecco (DPBS) su ghiaccio e delicatamente schiacciare loro di rilasciare sporozoiti.
NOTA: L'iniezione di una sospensione parassita altamente concentrata in un piccolo volume essere critico, è quindi essenziale per raccogliere un numero sufficiente di ghiandole salivari da un elevato numero di preselezionati zanzare ben infette, come dimostra il loro robusta espressioneverde-fluorescenza. - Filtrare la sospensione sporozoite attraverso un tappo colino cella 35 micron atto ad un'adesione 1,5 tubo partire ml microcentrifuga per eliminare grumi e detriti zanzara.
- Contare il numero totale di sporozoiti isolate come precedentemente descritto 21 e regolare la concentrazione della sospensione parassita freddo 1x DPBS avere 83.000 sporozoiti / microlitro. Conservare i parassiti sul ghiaccio, pur continuando i prossimi passi.
- Raccogliere il numero equivalente di ghiandole salivari di zanzare infette che verranno utilizzati come controllo negativo e processano il campione come descritto nei punti 2.2 e 2.3. Diluire il campione come indicato sopra per ottenere analoga concentrazione di estratti ghiandole salivari nella sospensione.
NOTA: sporozoiti possono essere memorizzati su ghiaccio per un massimo di 2 ore. Tuttavia, idealmente vengono iniettati nel giro di un'ora dopo la pigiatura delle ghiandole salivari.
3. L'iniezione di sporozoiti nella Dermal Layer del Ear
- Anestetizzare animali mediante iniezione intraperitoneale di ketamina (50 mg / kg) / xilazina (5 mg / kg) della miscela. Attendere 5-8 minuti per il mouse di essere in uno stato di incoscienza e applicare pomata oftalmica per gli occhi per evitare l'essiccazione della cornea. Valutare la profondità di anestesia eseguendo un pizzico punta dolce su entrambi i piedi posteriori.
NOTA: La dose di anestesia dura meno di 20 minuti, in modo che i prossimi passi deve essere fatto in fretta. - Stabilizzare il padiglione auricolare del mouse fissando il lato ventrale con nastro adesivo trasparente precedentemente posto sotto uno stereomicroscopio (Figura 1A). Premere delicatamente l'orecchio per evitare danni del sistema vascolare.
- Caricare un / 35 gauge smussato 10 microlitri siringa con 0,6 ml di parassiti risospese 10.
- Consegnare la sospensione sporozoite in 4 siti di iniezione (0,15 ml per sito) inserendo con cautela l'ago sul lato dorsale dell'orecchio (Figura 1A), sotto l'epidermide, conlo smusso up, avendo cura di evitare i vasi sanguigni. Lasciare l'ago di rimanere nel derma per pochi secondi per impedire il riflusso del injectant prima di rimuoverla. Osservare una papula caratteristico ciascun sito di iniezione al termine della procedura (Figura 1B e 1C).
- Dopo l'iniezione, rimuovere con attenzione l'orecchio dal nastro.
- Iniettare dell'orecchio controlaterale con la stessa dose di parassiti seguendo la procedura 3,2-3,4.
- Iniettare 2 topi supplementare sia con 0,6 ml di 1x DPBS o 0,6 ml di 1x DPBS + estratto di ghiandola salivare dalle zanzare infettate per valutare la risposta infiammatoria mediata dalla sola iniezione e la deposizione di materiale zanzare nel derma.
- Monitorare il recupero del mouse dall'anestesia prima di metterlo nuovamente dentro la gabbia.
NOTA: La deposizione sporozoite corretta nella pelle può essere monitorato mediante microscopia a fluorescenza (Figura 2A e 2B), Il mouse che viene preparato come descritto previsously 23.
4. Pelle e drenante dissezione linfonodale
- Preparare mezzo standard (SM) come segue: Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) + 25 mM 4- (2-idrossietil) -1-acido piperazineethanesulfonic (HEPES) supplementato con 400 U / ml di collagenasi e 50 ug / ml deossiribonucleasi (DNasi) .
- Preparare due 6 piastre di coltura dei tessuti ben a fondo piatto sul ghiaccio con 4,5 ml di SM + 70 micron cella filtro per bene per i campioni DLN (tavola A) e 4,5 ml di SM per bene per i campioni di pelle (piastra B).
- Al punto di tempo desiderato dopo l'inoculazione sporozoite, profondamente anestetizzare il mouse mediante iniezione intraperitoneale di ketamina (125 mg / kg) / xilazina (12,5 mg / kg) miscela prima dislocazione cervicale. Assicurarsi che il mouse dimostra segni di morte clinica e iniziare subito la dissezione.
NOTA: La cinetica di reclutamento delle cellule mieloidi possono essere esaminate in tempi diversi dopo injessione (cioè 2 ore, 4 ore e 24 ore come descritto in precedenza 14). - Disinfettare l'orecchio inoculato e la regione del collo corrispondente con il 70% di etanolo per ridurre la possibilità di contaminazione.
- Utilizzando forbici e pinze sterili, in modo asettico sezionare il prossimale auricolare DLN senza raccogliere il grasso circostante. Eseguire una prima incisione nel solco giugulo-carotidian e rimuovere i peli dal campo operatorio. Stretch l'incisione con 2 pinze per esporre il DLN che appare grigio rispetto al tessuto circostante.
- Pizzicare i tessuti connettivi attenzione sulla parte superiore del DLN con una pinza per facilitarne la rimozione. Estrarre il DLN mettendo una pinza sotto il tessuto linfoide (Figura 3A e 3B). Posizionare il DLN in un pozzo contenente colino cella 4,5 ml SM + 70 micron (tavola A).
- Raccolto l'intero orecchio inoculato usando forbici affilate sterili e pinze (Figura 4A). Separmangiato gli aspetti dorsale e ventrale dell'orecchio da pizzicare e distanziare il taglio termina con due pinze (Figura 4B - 4E). Mettetele in un pozzo contenente 4,5 ml di SM (tavola B) assicurandosi che entrambi i tessuti sono completamente immersi nel mezzo.
NOTA: Al fine di migliorare l'affidabilità dell'esperimento e aumentare il numero di cellule di interesse, pool 2 iniettato orecchie o 2 dLNs dallo stesso animale per campione. - Raccolta e processo in parallelo le orecchie e dLNs di topi inoculati sia con 1x DPBS o estratti delle ghiandole salivari. Include 2 ulteriori campioni per le orecchie e linfonodali raccolte da un mouse ingenuo per i controlli di compensazione colorazione negativa e singole.
5. isolamento delle cellule da linfonodi
- Incubare i linfonodi (tavola A) a 37 ° C + 5% di CO 2 per 15 minuti sotto agitazione. Aggiungere etilendiamminotetraacetico 10 mM finale (EDTA) per pozzetto per neutralizzare collagenasi e DNase actività. Eseguire i prossimi passi sul ghiaccio.
- Dissociare linfonodi utilizzando l'estremità superiore di una siringa stantuffo 5 ml. Press con movimenti circolari contro il filtro fino a quando non rimane che tessuti connettivi bianchi.
- Risciacquare il filtro delle cellule due volte con 500 ml DPBS 1x + 2% di siero fetale bovino (FBS) + 2mM EDTA. Trasferire intero volume del pozzetto in una provetta da 15 ml.
- Lavare il ben due volte con 500 microlitri DPBS 1x + 2% FBS + 2 mM EDTA e trasferire il volume nel tubo 15 ml. Mantenere i tubi in ghiaccio.
6. isolamento delle cellule dalla pelle del Ear
- Incubare i volantini per le orecchie (tavola B) a 37 ° C + 5% di CO 2 per 1 ora sotto agitazione.
NOTA: Dopo 20 min di incubazione, tagliare i volantini per le orecchie con le forbici in piccoli pezzi per facilitare la digestione dei tessuti e mettere il campione di nuovo in incubatrice per il restante 40 min. Singole cellule possono essere osservati in mezzo al termine del tempo di incubazione. - Aggiungere 10 mM finale EDTA per pozzetto per neutralizzare le attività collagenasi e DNasi. Eseguire i prossimi passi sul ghiaccio.
- Trasferire i frammenti di tessuto dell'orecchio e l'intero volume del mezzo in un nuovo pozzo contenente un filtro cella 70 micron con una pipetta 1 ml. Tagliare 2 a 3 mm dall'estremità della punta per raccogliere i frammenti di tessuto dell'orecchio più facilmente.
- Dissociare frammenti di tessuto dell'orecchio con l'estremità superiore di una siringa stantuffo 5 ml. Press con movimenti circolari contro il filtro fino a quando non rimane che tessuti connettivi bianchi.
- Lavare le cellule due volte con filtri 500 DPBS microlitri 1x + 2% FBS + 2 mM EDTA.
- Trasferire l'intero volume del pozzo in 50 ml-tubo attraverso un colino cella 70 micron.
- Risciacquare pozzo con 500 microlitri 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA e trasferire il volume nel tubo 50 ml. Mantenere la provetta in ghiaccio.
NOTA: Le diverse fasi di isolare cellule totali dalla pelle e tessuti DLN sono riassunti nella Figura 5.
- Centrifugare la pelle e campioni DLN per 5 min a 450 xg a 4 ° C e scartare il surnatante. Risospendere delicatamente il pellet con 300 ml DPBS 1x + 2% FBS + 2 mM EDTA.
- Raccogliere un piccolo volume di ogni campione per contare il numero totale di cellule isolate dalla pelle e DLN con un emocitometro. Aggiungere 0,04% trypan blu per determinare la vitalità cellulare.
8. Blocco di non antigene-specifica Binding
- Aggiungere 10 ug / ml di CD16 non marcato / CD32 Fc-block anticorpi. Incubare 20 minuti a 4 ° C (può andare più).
- Aggiungere 2 ml di freddo 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA. Centrifugare il campione per 5 minuti a 450 xga 4 ° C e scartare il surnatante. Risospendere delicatamente il pellet con 300 ml DPBS 1x + 2% FBS + 2 mM EDTA e mantenere i campioni in ghiaccio.
9. macchie sulla pelle e le cellule mieloidi Linfonodo
- Incubare sci precedentemente bloccaton e DLN isolato cellule con Live / inseguitore Morto (cioè 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole o DAPI), anti-CD45 e anti-CD11b anticorpi specifici.
NOTE: Al fine di arricchire le sottopopolazioni di cellule mieloidi di interesse, in particolare quelli rari, le cellule e linfociti CD45 + possono essere, rispettivamente, purificati dalla pelle o impoverito dal DLN dal tallone magnetica ordinamento delle cellule di facilitazione. Poiché la maggior parte delle cellule isolate dal DLN sono CD45 +, l'uso di anti-CD45 non è obbligatoria. Altri marcatori possono essere inclusi per identificare sottopopolazioni di cellule mieloidi di interesse dalla strategia positiva o negativa-gating. In questo protocollo, le cellule mieloidi reclutate nel DLN sono stati arricchiti escludendo cellule CD8α + (tutto il compartimento di cellule T può essere bersaglio di utilizzare anti-CD3 anticorpo specifico). - Incubare 30 minuti a 4 ° C al buio. Aggiungere 500 microlitri DPBS 1x + 2% FBS + 2 mM EDTA, centrifugare il campione 5 min a 450 xg a 4 ° C e scartare il supernatant. Ripetere la fase di lavaggio due volte.
- Risospendere i campioni con 300 microlitri DPBS 1x + 2% FBS + 2 mM EDTA. Trasferire l'intero volume in un tubo FACS attraverso un colino cella 35 micron. Lavare il filtro con 100 microlitri DPBS 1x + 2% FBS + 2 mM EDTA.
- Eseguire le cellule colorate in un citometro di flusso. Porta di vivere celle singole (DAPI -, FSC-W) di escludere le cellule morte e doppiette. Trama CD45 + CD11b + eventi per la pelle (figura 6A) e (CD45 +) CD8α - CD11b + eventi per il DLN (Figura 6B).
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Representative Results
Abbiamo recentemente dimostrato che l'ago-siringa per iniezione di immunizzare dosi di P. berghei sporozoiti nella pelle del mouse induce un reclutamento successiva di neutrofili polimorfonucleati seguite da monociti infiammatorie della pelle e DLN 19. La Sezione protocollo descritto in dettaglio la procedura utilizzata per isolare con successo cellule mieloidi dal vivo da entrambi i tessuti seguenti iniezioni multiple di gran numero di sporozoiti nel derma dell'orecchio sopra (figure 1 e 2). Entro il primo 24 ore, il DLN (Figura 3) e il sito di iniezione cutanea (Figura 4) sono stati isolati e trattati come riassunto in Figura 5 per analizzare l'infiltrazione cellulare dal flusso multi-parametrica citometria. Nel complesso, questa tecnica ci ha permesso di isolare una media 10 4 CD45 + CD11b + e 2.10 4 CD11b + dal vivo le singole cellulerispettivamente per la pelle e DLN. La vitalità accettabile di singole cellule non detriti variava dal 40-70% per la pelle e 70-90% per il DLN. Come mostrato in figura 6, la frequenza delle cellule mieloidi in pelle (CD45 + CD11b +) e il DLN (CD8α - CD11b +) fortemente aumenta dopo iniezione intradermica di RAS rispetto ai topi non infetti.
Figura 1: I ntradermal Iniezione di sporozoiti nell'orecchio di mouse. (A) Immagine che mostra l'iniezione intradermica di sporozoiti nel padiglione auricolare di un mouse anestetizzato. Il lato ventrale dell'orecchio è stabilizzato con nastro adesivo trasparente precedentemente posto sotto un microscopio da dissezione. L'ago viene accuratamente inserito sul lato dorsale dell'orecchio, sotto l'epidermide, con lo smusso up. (B - C) Le immagini del lato dorsale del padiglione auricolare precedente (B) e dopo (C) intradermica iniezione di 0,1-0,2 ml di sospensione parassita. Una papula caratteristica (freccia nera) è osservabile al sito di iniezione, alla fine dell'operazione. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
. Figura 2: Imaging di sporozoiti Depositata nel derma all'orecchio del mouse (A) microscopia a fluorescenza che mostra RAS migrazione dal sito di iniezione (indicata dalle linee tratteggiate) nella pelle del mouse 15 min dopo l'iniezione (bar scala = 60 micron; 10X ingrandimento). Il percorso di sporozoiti è rappresentata dalla proiezione massima intensità del segnale fluorescente. Verde e rosso di fluorescenza remostrano rispettivamente la posizione del parassita nella pelle all'inizio e dopo 10 secondi di acquisizione. (B) maggiore ingrandimento di RAS (verde) iniettato nella pelle (Barra di scala = 20 micron; 25X di ingrandimento). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Drenaggio linfatico Picture nodo di elaborazione (A) che mostra la dissezione del prossimale auricolare DLN dopo l'iniezione intradermica di Evans blu per scopi dimostrativi.. Dopo dislocazione cervicale del mouse, il collo è disinfettata con etanolo al 70%. Una prima incisione viene fatta nella zona giugulare-carotidea con forbici affilate e la pelle viene rimosso dal campo operatorio. L'incisione è allungata con 2 pinze per esporre il DLN che appare grAyish rispetto al tessuto circostante. I tessuti connettivi sono poi accuratamente schiacciati con una pinza sulla parte superiore del DLN e progressivamente separati da esso. Infine, il DLN viene estratto mettendo una pinza sotto il tessuto linfoide. (B) Immagine che mostra il DLN estratto in una goccia di PBS. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4:. Ear lavorazione della pelle Immagini che mostrano le fasi successive per elaborare l'orecchio inoculato. (A) Dopo dislocazione cervicale del mouse, l'orecchio viene disinfettata con il 70% di etanolo e rimossi con forbici affilate sterili e pinze. (B - D) La dorsale e ventrale aspetti delle orecchie sono leggermente separate da pizzicare e sstimolazione a parte il taglio si chiude con due pinze. (E) Immagine che mostra gli aspetti dorsale e ventrale dell'orecchio previo trattamento enzimatico. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5:.. Protocollo Sommario Rappresentazione schematica dei passaggi chiave per isolare le cellule totali dalla pelle e dei tessuti DLN Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6: mieloide popolazione di cellule isolato dalla pelle dell'orecchio e il prossimale DLN FACS Rappresentante trame che mostrano la.strategia di gating per analizzare il compartimento mieloide nella pelle (A) e il DLN (B). CD45 + CD11b + e CD8α - cellule CD11b + sono stati gated sul totale eventi singoletto dal vivo rispettivamente per la pelle e DLN. Per ogni condizione, 5 x 10 5 eventi totali sono stati acquisiti (2 orecchie e 2 DLN raggruppati per campione). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Nella prospettiva della vaccinazione su larga scala degli esseri umani utilizzando un intero vaccino contro la malaria sporozoite, una delle principali sfide da superare è quello di sviluppare percorsi e metodi di somministrazione parassita ottimizzati per garantire l'immunizzazione e la protezione 24,25 successo. Negli esseri umani, la valutazione della efficacia protettiva mediata da parassiti vivi attenuati (LAP) sono seguite zanzara naturale morde 2, nonché intradermica, sottocutanea 25,26 e IV vaccinazioni 27. Come riportato nei roditori 28 e primati non umani 25, la somministrazione endovenosa di LAP induce risposte immunitarie protettive più forti rispetto ai percorsi di cui sopra. Tuttavia, le rotte non-IV di amministrazione usando ago e la siringa continuano ad essere più adatto per la vaccinazione di massa umana e gli sforzi sono attualmente in corso per ottimizzare la loro efficacia protettiva.
Recenti studi condotti su topi dimostranod, specialmente nel caso della rotta ID, che la deposizione di un piccolo volume di sospensione sporozoite (gamma di 1 ml) in diversi siti di iniezione (4 punti) significativamente maggiore infettività parassita rispetto ad una singola inoculazione di parassiti diluito in grandi volumi (50 ml) 24. Nel nostro sistema sperimentale (C57BL / 6 del mouse - P. berghei), la protezione completa è stata raggiunta dopo iniezioni multiple nel derma per le orecchie di sospensione altamente concentrata di parassiti (50.000 RAS in 0,6 ml, 4 siti di iniezione) 19. In questo contesto, abbiamo stabilito il protocollo descritto in precedenza per analizzare con maggiore precisione la risposta immunitaria locale per immunizzazione dosi di RAS che ci ha permesso di individuare 2 principali sottopopolazioni di cellule mieloidi reclutati nella pelle e DLN in risposta al parassita 19.
flusso multi-parametrico permette citometria accurata identificazione e quantificazione dei cambiamenti di cellule immunitarie nel contesto della risposta dell'ospitealle infezioni 19,20. L'isolamento di un gran numero di cellule vitali è quindi fondamentale per eseguire analisi fenotipica riproducibile. A questo scopo, la concentrazione dell'enzima e la durata della digestione tessuti devono essere ottimizzate. Infatti, bassa concentrazione di enzimi o tempo di incubazione insufficiente può portare a digestione incompleta con bassa resa delle cellule mentre prolungata digestione dei tessuti può provocare la vitalità delle cellule diminuzione e l'alterazione della superficie cellulare antigene di espressione 29. Tuttavia, è stato dimostrato protocolli ben consolidati con trattamento collagenasi di avere un impatto marginale sulla rilevabilità di molecole di superficie rilevanti frequentemente utilizzate per fenotipica analisi 30.
Tra i vari parametri in grado di ottimizzare la qualità di isolamento delle cellule, la separazione della dorsale e sezioni ventrali della pelle dell'orecchio è essenziale, in quanto permette di collagenasi / DNAsi per accedere derma. Inoltre, macinazione la pelle nel piccolopezzi aumenta l'area di superficie accessibile agli enzimi, permettendo quindi minore durata della digestione. Infine, l'uso di dissociazione meccanica contribuisce ad aumentare la resa del numero di cellule sia per la pelle e DLN. Tuttavia, l'eccessiva dissociazione può determinare un'ulteriore sollecitazione che potrebbe avere un impatto negativo vitalità cellulare.
Abbiamo favorito l'acquisizione di cellule vive da fissazione porta alla colorazione ottimale, complicando distinzione di rari casi risultati positivi (dati non riportati). Inoltre, la discriminazione delle cellule morte era più problematico. Nei casi in cui è richiesta la fissazione delle cellule, si suggerisce l'utilizzo di / DEAD risolvibili macchie di cellule morti vivono.
Utilizzando il protocollo definito, noi con successo isolate cellule mieloidi infiltranti nella pelle e DLN in risposta a Parasite iniezione (figura 6A e B). Di solito ottenere livelli elevati di singole cellule vitali dal DLN (70-90%) rispetto alpelle (40-70%). Questa differenza può essere spiegata con il tempo di incubazione è più necessaria per la digestione enzimatica efficiente insieme a ulteriori fasi di dissociazione meccanica per isolare le cellule della pelle (pelle separazione dello strato, tritare e forte schiacciare).
Infine, un parametro importante prendere in considerazione quando si analizza la risposta dell'ospite ID iniezione di sporozoiti è il livello di infiammazione indotta da entrambi inserimento dell'ago e salivari zanzara deposizione estratto ghiandola nella pelle 19,20. Si consiglia quindi di iniettare topi supplementare con solo sia 1x PBS o salivari estratti ghiandole dallo stesso numero di zanzare non infette per valutare la risposta immunitaria specifica indotta dal parassita. Complessivamente, si consiglia di sezionare zanzare infette con elevati livelli di parassita nelle ghiandole salivari e per filtrare la sospensione del parassita per limitare la quantità di materiale di zanzara che potrebbe essere depositato nella pelle.
ion sintesi, l'isolamento di cellule mieloidi dalla pelle e DLN attraverso il protocollo descritto fornisce un test affidabile per valutare cambiamenti cellulari dinamiche durante la risposta infiammatoria alle infezioni Plasmodium e può essere estesa ad altri patogeni trasmessi nella pelle dell'ospite.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Patricia Baldacci, Vanessa Lagal e Sabine Thiberge per la lettura critica, Irina Dobrescu e Sabine Thiberge aiuto per scattare foto e Pauline Formaglio per l'insegnamento imaging in vivo di sporozoite motilità nella pelle del mouse. Vorremmo anche ringraziare Marek Szatanik e il Centro di Produzione e infezione di Anopheles (CEPIA-Institut Pasteur) per l'allevamento di zanzare. Questo studio è stato sostenuto dal Fondo AXA Ricerca e fondi dal Laboratoire d'Excellence "Biologia Integrativa di Emerging Infectious Diseases" (Grant no. ANR-10-LabX-62-IBEID).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine: Imalgene® 1,000 | Merial | - | 50 mg/kg: prior sporozoite injection 125 mg/kg: prior sacrifice |
| Xylazine: Rompun® 2% | Bayer | - | 5 mg/kg: prior sporozoite injection 12.5 mg/kg: prior sacrifice |
| NanoFil syringe + 35 gauge needle | World Precision Instruments | - | - |
| Omnican® 50 Insulin syringe 0.5 ml/50 I.U. | B. Braun Medical | 9151125 | - |
| MultiwellTM 6 well tissue culture plate – Flat Bottom | BD Falcon | 353046 | - |
| 70 µm cell strainer | BD Falcon | 352350 | - |
| 2 ml syringe | Terumo | SS-02S | - |
| BLUE MAXTM 15 ml Polypropylene conical tube | BD Falcon | 352097 | - |
| BLUE MAXTM 50 ml Polypropylene conical tube | BD Falcon | 352098 | - |
| 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube with 35 µm Cell-Strainer Cap | BD Falcon | 352235 | - |
| DPBS 1x CaCl2- and MgCl2--free | Life Technologies | 14190-094 | - |
| DMEM 1x + GlutaMAXTM | Life Technologies | 31966-021 | - |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type IV 0.5-5.0 FALGPA units/mg solid | Sigma-Aldrich | C5138 | 400 U/ml |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type IV | Sigma-Aldrich | D5025 | 50 µg/ml |
| EDTA disodium salt | Sigma-Aldrich | E-5134 | 10 mM or 2.5 mM |
| FBS | Biowest | S1810-500 | - |
| HEPES buffer solution (1M) | Gibco | 15630-056 | 25 mM |
| Trypan blue Stain (0,4%) | Life Technologies | 15250-061 | Dilution 1:10 |
| Anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2 clone) | BD Biosciences | 553142 | 10 µg/ml final (1:50) |
| DAPI FluoroPureTM grade | Life Technologies | D21490 | 1 µg/ml final |
| Anti-mouse CD45 (30-F11 clone) | BD Biosciences | 559864 | Dilution 1:200 |
| Anti-mouse CD11b (M1/70 clone) | BD Biosciences | 557657 | Dilution 1:400 |
| Anti-mouse CD8α (5H10 clone) | Life Technologies | MCD0830 | Dilution 1:100 |
| Female C57BL/6JRj mice (7-week-old) | Janvier Laboratories | - | - |
References
- Nussenzweig, R. S., Vanderberg, J., Most, H., Orton, C. Protective immunity produced by the injection of x-irradiated sporozoites of plasmodium berghei. Nature. 216 (5111), 160-162 (1967).
- Hoffman, S. L., et al. Protection of humans against malaria by immunization with radiation-attenuated Plasmodium falciparum sporozoites. J Infect Dis. 185 (8), 1155-1164 (2002).
- Mueller, A. K., et al. Plasmodium liver stage developmental arrest by depletion of a protein at the parasite-host interface. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (8), 3022-3027 (2005).
- Mueller, A. K., Deckert, M., Heiss, K., Goetz, K., Matuschewski, K., Schlüter, D. Genetically attenuated Plasmodium berghei liver stages persist and elicit sterile protection primarily via CD8 T cells. Am J Pathol. 171 (1), 107-115 (2007).
- Tarun, A. S., et al. Protracted sterile protection with Plasmodium yoelii pre-erythrocytic genetically attenuated parasite malaria vaccines is independent of significant liver-stage persistence and is mediated by CD8+ T cells. J Infect Dis. 196 (4), 608-616 (2007).
- van Dijk, M. R., et al. Genetically attenuated, P36p-deficient malarial sporozoites induce protective immunity and apoptosis of infected liver cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (34), 12194-12199 (2005).
- Butler, N. S., Schmidt, N. W., Vaughan, A. M., Aly, A. S., Kappe, S. H., Harty, J. T. Superior antimalarial immunity after vaccination with late liver stage-arresting genetically attenuated parasites. Cell Host Microbe. 9 (6), 451-462 (2011).
- Belnoue, E., et al. Protective T cell immunity against malaria liver stage after vaccination with live sporozoites under chloroquine treatment. J Immunol. 172 (4), 2487-2495 (2004).
- Behet, M. C., et al. Sporozoite immunization of human volunteers under chemoprophylaxis induces functional antibodies against pre-erythrocytic stages of Plasmodium falciparum. Malar J. 13, 136 (2014).
- Amino, R., et al. Quantitative imaging of Plasmodium transmission from mosquito to mammal. Nat Med. 12 (2), 220-224 (2006).
- Yamauchi, L. M., Coppi, A., Snounou, G., Sinnis, P. Plasmodium sporozoites trickle out of the injection site. Cell Microbiol. 9 (5), 1215-1222 (2007).
- Gueirard, P., et al. Development of the malaria parasite in the skin of the mammalian host. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (43), 18640-18645 (2010).
- Voza, T., Miller, J. L., Kappe, S. H., Sinnis, P. Extrahepatic exo- erythrocytic forms of rodent malaria parasites at the site of inoculation: clearance after immunization, susceptibility to primaquine, and contribution to blood-stage infection. Infect Immun. 80 (6), 2158-2164 (2012).
- CD8+ T lymphocytes protective against malaria liver stages are primed in skin-draining lymph nodes. Nat Med. Chakravarty, S., Cockburn, I. A., Kuk, S., Overstreet, M. G., Sacci, J. B., Zavala, F. 13 (9), (2007).
- Obeid, M., et al. Skin-draining lymph node priming is sufficient to induce sterile immunity against pre-erythrocytic malaria. EMBO Mol Med. 5 (2), 250-263 (2013).
- Amino, R., et al. Host cell traversal is important for progression of the malaria parasite through the dermis to the liver. Cell Host Microbe. 3 (2), 88-96 (2008).
- Radtke, A. J., et al. Lymph-node resident CD8α+ dendritic cells capture antigens from migratory malaria sporozoites and induce CD8+ T cell responses. PLoS Pathog. 11 (2), e1004637 (2015).
- da Silva, H. B., et al. Early skin immunological disturbance after Plasmodium-infected mosquito bites. Cell Immunol. 277 (1-2), 22-32 (2012).
- Mac-Daniel, L., et al. Local immune response to injection of Plasmodium sporozoites into the skin. J Immunol. 193 (3), 1246-1257 (2014).
- Ribeiro-Gomes, F. L., Peters, N. C., Debrabant, A., Sacks, D. L. Efficient capture of infected neutrophils by dendritic cells in the skin inhibits the early anti-leishmania response. PLoS Pathog. 8 (2), e1002536 (2012).
- Thiberge, S., et al. In vivo. imaging of malaria parasites in the murine liver. Nat Protoc. 2 (7), 1811-1818 (2007).
- Ishino, T., Orito, Y., Chinzei, Y., Yuda, M. A calcium-dependent protein kinase regulates Plasmodium ookinete access to the midgut epithelial cell. Mol Microbiol. 59 (4), 1175-1184 (2006).
- Amino, R., et al. Imaging malaria sporozoites in the dermis of the mammalian host. Nat Protoc. 2 (7), 1705-1712 (2007).
- Ploemen, I. H., et al. Plasmodium liver load following parenteral sporozoite administration in rodents. Vaccine. 31 (34), 3410-3416 (2013).
- Epstein, J. E., et al. Live attenuated malaria vaccine designed to protect through hepatic CD8 T cell immunity. Science. 334 (6055), 475-480 (2011).
- Roestenberg, M., et al. Long-term protection against malaria after experimental sporozoite inoculation: an open-label follow-up study. Lancet. 377 (9779), 1770-1776 (2011).
- Seder, R. A., et al. Protection against malaria by intravenous immunization with a nonreplicating sporozoite vaccine. Science. 341 (6152), 1359-1365 (2013).
- Douradinha, B., et al. Genetically attenuated P36p-deficient Plasmodium berghei sporozoites confer long-lasting and partial cross-species protection. Int J Parasitol. 37 (13), 1511-1519 (2007).
- Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine. J Vis Exp. (63), e4040 (2012).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur J Microbiol Immunol (Bp. 2 (2), 112-120 (2012).
