的简化方法超低密度，长期主要海马神经元文化
Summary
Low density cultures of primary hippocampal neurons usually require glia feeder layer to supply neurotrophic factors and sustain longevity. We describe here a simplified method to culture ultra-low density neurons on glass coverslips in the presence of a high density neuronal feeder layer, which facilitates investigation of specific neuronal-autonomous mechanisms.
Abstract
在体外培养初级海马神经元促进了神经发育的许多方面机械审讯。解离的胚胎海马神经元通常可以成功地在玻璃盖玻片上以高密度生长在无血清条件下，但低密度培养物典型地需要通过营养因子的供给共培养它们与神经胶质饲养层，制备其中可费时又费力。此外，神经胶质细胞的存在可能混淆对神经元特异性的机制的结果和预先排除研究解释。在这里，一个简单的方法，提出了超低密度（〜2000元/厘米2），长期（> 3个月）原海马神经元的文化，是无血清条件下，无胶质细胞的支持。低密度的神经元生长在聚-D-赖氨酸涂覆的盖玻片，并翻转在一个24孔板生长高密度的神经元。除了使用石蜡点来创造一个空间betwee的两个N神经细胞层，实验者可以简单地蚀刻井的底部塑料，对其中的高密度居住的神经元，创造一个有利于低密度神经生长微小空间。共培养可以很容易地维护> 3个月无低密度的神经元显著损失，从而促进这些神经元的形态和生理研究。为了说明这一点成功的培养条件下，提供的数据显示长期培养后满头突触形成的低密度细胞。此共培养体系还便于在聚-D-赖氨酸衬底并因此autaptic连接的形成的岛屿生长稀疏单个神经元的存活。
Introduction
在体外条件下生长的海马神经元能够观察和这些神经元是否则不可能在体内的实验操作。此实验方法被广泛地用于揭示增长，极性，轴突说明书中，贩卖和蛋白质的亚细胞定位，突触形成和功能成熟1的神经元的机制。 这些体外培养海马神经元，从后期胚胎阶段时采收，是比较纯粹的金 字塔形态2的（> 90％），谷氨酸能细胞。因为神经元中的2-D表面在体外条件下生长的，这种方法可以方便地观察，如实时成像或免疫细胞化学（ICC）通过单个焦平面3染色;或操作，比如药物治疗和转染3-6。当高密度的增长，神经元往往因为较高的共同生存率高在除了消化道的支持从生长媒介和，也因为突起接触依赖性机制分泌7生长因子ncentrations。然而，低密度的海马神经元是可取的形态学研究，其中一个单独的神经元可在其全部被成像或染色的ICC分析。低密度的神经元是很难培养维持由于缺乏旁分泌的支持，因此往往需要从胶质（通常为皮质星形胶质细胞）饲养层，它具有神经元文化2之前做好准备营养支持。当共同培养与神经胶质细胞饲养层，低密度的神经元生长在盖玻片上，然后在神经胶质细胞层的顶部翻转，使得低密度的神经元和神经胶质彼此面对。是由放置在盖玻片的角落石蜡点，因此创造了“三明治”布局2,8,9创建胶质细胞和神经元之间的一个小的密闭空间。低密度的神经元将增长W¯¯ithin胶质细胞和盖玻片，创建由神经元和神经胶质细胞分泌的因素集中一个宽容的微环境之间的密闭空间。这种方法产生的低密度，通过合理隔开充分发展的神经元，因此促进IC卡的标签或活成像研究。
神经胶质细胞共培养的表观缺点，除了是费时和费力的，是防止神经元特异性的，或细胞自主，机制研究。虽然这个系统比远小于复合体内神经组织，通过分泌的，还未完全限定因素对神经元发育神经胶质细胞的影响可以混淆实验10。因此，在需要的神经元特异性机制查，确定的培养条件除去血清和胶质支撑层是必要的实验。先前的研究已经成功地培养使用次低浓度的神经元（〜9000个/厘米2）稀土元素维水凝胶基质11。由于相对较纯的神经元群体可以在无需胶质支持无血清条件下的高密度进行培养，我们推测海马神经元的超低密度可以在无血清定义培养基由生长共培养它们与高密度的神经元，在的方式，是类似于常规采用神经胶质细胞共培养。事实上，在“三明治”结构的高密度的海马神经元的文化已经被用来支持少数专业大细胞神经内分泌12。
因此，共培养具有高密度的神经元可以允许低密度的神经元得到的营养因子支持足以使长期生存。由此培养超低密度神经元的这个协议配制和验证。该协议可以在一个单一实验中实现，通过制备高密度（〜250,000个细胞/ ml）的DISsociated海马神经元，然后再制作稀释，得到密度〜万个神经元/毫升（〜3000个神经元/盖玻片，或〜2000个神经元/厘米2），这比大多数报道的低密度培养物低得多的2,3,9 ，11,13。这种培养条件是松散称为“超低密度的文化和与'低密度'间可变地使用。高密度的神经元接种于聚-D-赖氨酸涂覆的24孔板;而低浓度的神经元上的聚-D-赖氨酸涂覆的12毫米的玻璃盖玻片接种被放置在另一个24孔板内。与粘附的低密度的神经元的盖玻片2小时后翻转的高密度的神经元的顶部的神经元被下降并附着在盖玻片后。此外，代替使用石蜡点以提升高密度的神经元层上面的盖玻片，18G的注射器针头被用于蚀刻24孔板的底部，具有两个平行的条纹。由此产生的显示终端ACED，毗邻塑料提供的盖玻片升高支持。该空间是在150-200微米，允许足够的氧和培养基交换，同时提供用浓营养因子微环境一致地测量。在这种条件下，低浓度的神经元广泛生长，并可以超出培养3个月生存。当这些神经元在培养三周后与GFP质粒转染的树突大汗与树突棘云集。原则上证明，数据都表明，这种合作培养体系支持接种在聚-D-赖氨酸的“微孤岛”，这里的神经元形成可以促进细胞的调查autaptic连接海马神经元的超低密度文化-autonomous，独立于网络的机制。
Protocol
Representative Results
Discussion
我们提出了无血清条件下的超低密度的海马谷氨酸能神经元的长期培养一个详细的协议。在〜2000个神经元/厘米2，密度比具有或不具有通过现有的文献2,3,11,13,14报道胶质支持最“低密度”培养制剂至少低两倍。除了作为超低密度，该协议是新颖的和在两个方式显著。第一，不需要胶质饲养层作为低密度的神经元得到从高密度的神经元是物理非常接近的范围内的营养因子的支持，即…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by an NIH/NIMH grant to S.Q. (R00MH087628).
Materials
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | Protect from light |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | aliquot, store in 0.6ml size |
| GlutaMAX-I | Life Technologies | 35050-061 | dilute 100X |
| antibiotic-antimycotic (AA) | Life Technologies | 15240-096 | dilute 100X |
| Complete Culture medium | Neurobasal medium with 1X B27, 1X AA, 1X GlutaMAX-I | ||
| Wash medium | same as 'Neurobasal medium' | ||
| Feed medium | Neurobasal with 1X B27 supplement | ||
| DNAse I | Sigma-Aldrich | D5025 | prepare 100X stock at 0.6mg/ml |
| poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | M.W. 70000-150000 |
| borate buffer | Sigma-Aldrich | B6768 (boric acid); 71997(borax) | 1.24g boric acid & 1.9g borax in 400ml H2O, pH to 8.5 use HCl |
| 12-mm round glass coverslips | Glasswarenfabrik Karl Hecht GmbH | 1001/12 | No. 1 glass, purchase from Carolina Biological Supply |
| proFection transfection kit | Promega | E1200 | see protocol for details |
| 2X HEPES buffered saline (HBS) | Promega | E1200 | see protocol for details |
| Syringe filter | Pall Corporation | 4192 | 0.2um pore size |
| Endofree plasmid prep kit | Qiagen | 12362 | for preparation of transfection grade plasmid DNA |
| anti-MAP2 antibody | Millipore | MAB3418 | mouse antibody, clone AP20 |
| anti-p-Tau antibody | Millipore | AB10417 | rabbit polyclonal antibody |
| anti-NR1 antibody | Millipore | MAB1586 | mouse antibody, clone R1JHL |
| anti-GluR1 antibody | Millipore | AB1504 | rabbit polyclonal antibody |
| Hank's balanced salt solution | ThermoFisher | 14025092 | 500ml size |
Referências
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