Ein vereinfachtes Verfahren für Ultra-Low Density, Long-Term Primäre Hippocampus Kultur

Summary

Low density cultures of primary hippocampal neurons usually require glia feeder layer to supply neurotrophic factors and sustain longevity. We describe here a simplified method to culture ultra-low density neurons on glass coverslips in the presence of a high density neuronal feeder layer, which facilitates investigation of specific neuronal-autonomous mechanisms.

Abstract

Die Kultivierung primäre Neuronen im Hippocampus in vitro erleichtert mechanistischen Abfrage von vielen Aspekten der neuronalen Entwicklung. Dissoziierten embryonalen hippocampalen Neuronen können oft erfolgreich auf Glasdeckgläschen in hoher Dichte unter serumfreien Bedingungen wachsen, aber niedriger Dichte Kulturen erfordern typischerweise eine Zufuhr von trophischen Faktoren durch Co-Kultivieren mit einer Glia feeder layer, deren Herstellung zeitaufwendig sein kann und mühsam. Darüber hinaus kann das Vorhandensein von Glia Interpretation der Ergebnisse und preclude Studien über neuronenspezifische Mechanismen vermengen. Hier wird ein vereinfachtes Verfahren für ultraniedriger Dichte (~ 2.000 Neuronen / cm ^2), langfristige (> 3 Monate) primären Hippocampus Kultur präsentiert , die unter serumfreien Bedingungen und ohne Gliazellen Unterstützung. Niedrige Dichte Neuronen sind auf Poly-D-Lysin beschichtete Deckgläser aufgewachsen, und blätterte auf hoher Dichte Neuronen in einer 24-Well-Platte gewachsen. Anstelle von Paraffin Punkte mit einem Raum zu schaffen between die beiden neuronalen Schichten können die Experimentatoren einfach ätzen die Kunststoff-Boden des Brunnens, an dem die mit hoher Dichte Neuronen befinden, einen Mikroraum förderlich für die geringe Dichte Neuron Wachstum zu schaffen. Die Co-Kultur kann leicht für> 3 Monate ohne signifikanten Verlust der niedriger Dichte Neuronen aufrecht erhalten werden, wodurch die morphologischen und physiologischen Untersuchung dieser Neuronen zu erleichtern. Um diese erfolgreiche Kulturbedingungen zu erläutern, werden Daten zur Verfügung gestellt in Zellen mit niedriger Dichte nach längerer Kultur reichlich Synapsenbildung zu zeigen. Diese Co-Kultursystem erleichtert auch das Überleben von Neuronen in sparse einzelnen Inseln aus Poly-D-Lysin-Substrate und damit die Bildung von autaptic Verbindungen gezüchtet.

Introduction

Hippokampus – Neuronen Anbau unter in vitro Bedingungen ermöglicht Beobachtungen und experimentelle Manipulation dieser Neuronen , die sonst nicht möglich sind , in vivo. Dieser experimentelle Ansatz ist weit verbreitet ¹ zu offenbaren neuronalen Mechanismen des Wachstums, der Polarität, Neuriten – Spezifikation, des Handels und der subzellulären Lokalisation von Proteinen, die Synapsenbildung und funktionelle Reifung verwendet. Diese in vitro kultivierten Hippocampus – Neuronen, wenn sie von späten embryonalen Stadien geerntet, sind relativ rein (> 90%) glutamatergen Zellen der Pyramiden Morphologie ^2. Da Neuronen in einer 2-D – Oberfläche unter in vitro Bedingungen gezüchtet wurden, ermöglicht diese Methode eine einfache Beobachtung, wie die Live – Darstellung oder Immunzytochemie (ICC) über eine einzige Brennebene Färbung ^3; oder Manipulationen, wie medikamentöse Behandlung und Transfektionen ^3-6. Wenn bei hoher Dichte gezüchtet, neigen Neuronen hohe Überlebensraten haben wegen der höheren Concentrations von sezernierten Wachstumsfaktoren zusätzlich zu Verdauungs Unterstützung der Wachstumsmedien und auch wegen der Neuriten kontaktabhängige Mechanismen ^7. Allerdings sind niedriger Dichte Neuronen im Hippocampus wünschenswert für morphologische Studien, in denen ein einzelnes Neuron kann in seiner Gesamtheit oder gebeizt für ICC-Analyse abgebildet werden. Geringer Dichte Neuronen sind schwer in Kultur zu halten aufgrund des Fehlens von parakrine Unterstützung und erfordern daher oft trophische Unterstützung von einer glialen (typischerweise kortikalen Astrozyten) feeder layer, die vor dem Neuron Kultur ² vorbereitet werden muss. Wenn co-kultiviert mit einer Gliazellen Feeder-Schicht, sind niedriger Dichte Neuronen auf Deckgläsern gezüchtet, und blätterte dann auf der Oberseite der Schicht Glia, so dass die geringe Dichte Neuronen und Gliazellen sind einander zugewandt sind. Ein kleiner begrenzten Raum zwischen Glia und Neuronen ist , indem Paraffinwachs Punkte an den Ecken der Deck erstellt, also eine "Sandwich" Layout ^2,8,9 erzeugen. Die geringe Dichte Neuronen wachsen wnnerhalb den engen Raum zwischen Gliazellen und dem Deckglas, das von Neuronen und Glia sezerniert eine permissive Mikro mit konzentrierter Faktoren erstellt. Dieser Ansatz führt zu geringer Dichte, voll entwickelten Neuronen, die einigermaßen voneinander entfernt sind, also ICC Kennzeichnung oder Live-Imaging-Studien erleichtern.

Ein scheinbarer Nachteil Neuron-Glia-Co-Kultur, abgesehen davon, dass zeitraubend und arbeitsaufwendig ist, dass es Studium der neuronenspezifische, oder zellautonomen, Mechanismen verhindert. Obwohl dieses System ist weit weniger komplex als in vivo Nervengewebe, Glia Auswirkungen auf neuron Entwicklung durch sezerniert noch-nicht-vollständig definierte Faktoren können die Experimente ¹⁰ vermengen. Daher wird in Experimenten, die die Untersuchung von Neuron spezifische Mechanismen erfordern, definierten Kulturbedingungen, die Serum und Glia-Trägerschicht erforderlich sind, zu entfernen. In einer früheren Studie wurde in Züchten niedrigen Konzentrationen von Neuronen (~ 9.000 Zellen / cm ²⁾ unter Verwendung eines th gelungenree dimensionale Hydrogelmatrix ^11. Da eine relativ reine kann neuronalen Population mit hoher Dichte unter serumfreien Bedingungen ohne glial Unterstützung kultiviert werden, hypothesize wir, dass ultra-niedrige Dichte von hippocampalen Neuronen in serumfreien definierten Kulturmedium durch Co-Kultivieren mit hoher Dichte Neuronen gezüchtet werden, in eine Möglichkeit, die der konventionell angenommen Neuron-Glia-Kokultur analog ist. Tatsächlich wurden hohe Dichte hippocampalen Neuronenkulturen in einer "Sandwich" -Konfiguration vor kurzem eine kleine Anzahl von spezialisierten magnozellulären endokrinen Neuronen ¹² zur Unterstützung verwendet wird .

Daher Co-Kultur mit hoher Dichte Neuronen erlauben kann niedriger Dichte Neuronen trophischen Faktoren Unterstützung zu erhalten, die langfristige Überleben zu ermöglichen, ausreichend ist. Dieses Protokoll der Kultivierung mit ultraniedriger Dichte Neuronen wurde so formuliert und validiert. Das Protokoll kann in einem einzigen Experiment durchgeführt, mit hoher Dichte Herstellung von (~ 250.000 Zellen / ml) disvergesellschafteten Neuronen im Hippocampus zuerst, und macht dann eine Verdünnung mit einer Dichte ~ 10.000 Neuronen zu erhalten / mL (~ 3.000 Neuronen / Deckglas oder ~ 2.000 Neuronen / cm ^2), die viel niedriger ist als in den meisten Kulturen mit geringer Dichte berichtet ^{2,3,9 , 11,13.} Diese Kultur Zustand lose bezeichnet als "ultra-niedriger Dichte" Kultur und verwendet mit "niedriger Dichte" inter-changeably. Die hohe Dichte Neuronen werden auf der Poly-D-Lysin beschichtete Platten mit 24 Vertiefungen plattiert; während die geringe Dichte Neuronen auf Poly-D-Lysin-beschichtete 12-mm Glasplättchen ausgesät werden, die in einem anderen 24-Well-Platte angeordnet sind. Die Deckgläser mit geringer Dichte Neuronen haften auf der Oberseite der hohen Dichte Neuronen 2 Stunden später gekippt, nachdem die Neuronen abstammen und auf die Deckgläser angebracht. Zusätzlich anstelle Paraffin Punkte der Verwendung zu erhöhen, wurde die Deckgläser über der hohen Dichte Neuronenschicht, eine 18 G Injektionsnadel verwendet, um den Boden der 24-Well-Platten mit zwei parallelen Streifen zu ätzen. Die resultierende displaced, angrenzende Kunststoffe bieten eine erhöhte Unterstützung für die Glasplättchen. Dieser Raum wird konstant auf 150 bis 200 & mgr; m gemessen, die ausreichend Sauerstoff und Kulturmedium Austausch ermöglicht, während eine Mikroumgebung mit konzentrierter Nahrungsfaktoren bereitstellt. Unter dieser Bedingung wachsen die niedriger Dichte Neuronen extensiv und über drei Monate in Kultur überleben können. Wenn diese Neuronen mit GFP-Plasmid nach drei Wochen in Kultur transfiziert sind, werden die Dendriten überschwänglich mit dendritischen Dornen besetzt. Als Beweis für das Prinzip werden die Daten zu zeigen, präsentiert, dass diese Co-Kultursystem mit ultraniedriger Dichte Kulturen von Neuronen im Hippocampus auf Poly-D-Lysine "Mikro-Inseln", wo Neuronen bilden autaptic Verbindungen ausgesät unterstützt die Untersuchung von Zell erleichtern -autonomous, netzunabhängige Mechanismen.

Protocol

Alle experimentellen Verfahren Mäuse beteiligt sind, wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee der University of Arizona genehmigt, und NIH-Richtlinien angepasst. 1. Gewebequelle für Hippocampus Kultur Pränatale Maus Welpen für Hippocampus Kultur zu erzeugen, verwenden zeit trächtige Mäuse (C57Bl6 / J), die im Haus 17 gezüchtet werden. Der Tag mit Vaginalpfropfens Erkennung wird als E0.5 bezeichnet. Die geplante Erntezeit für die Kultur ist E16….

Representative Results

Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht erfolgreiche ultra-niedriger Dichte, langfristige Kultur der reinen glutamatergen Neuronen, ohne die Notwendigkeit von Glia-Zellen als Feeder-Schicht dient. Das Protokoll ist in Abbildung 1 graphisch dargestellt, die die Herstellung von hoher Dichte beinhaltet (auf Poly-D-Lysin 24 Vertiefungen beschichtet) und niedriger Dichte Neuronen (auf Poly-D-Lysin beschichteten Glasplättchen) getrennt, und anschließender Co-Kultur , die…

Discussion

Wir präsentieren ein detailliertes Protokoll für die Langzeitkultur von ultra-niedriger Dichte des Hippocampus glutamatergen Neuronen unter serumfreien Bedingungen. Bei ~ 2000 Neuronen / cm ² ist die Dichte mindestens zweifach niedriger ist als die meisten "niedriger Dichte" Kultur Zubereitungen mit oder ohne ^2,3,11,13,14 durch die bestehende Literatur berichtet Glia – Unterstützung. Zusätzlich zu ultra-niedriger Dichte ist, ist dieses Protokoll neu und signifikant in zwei weitere Mö…

Materials

Neurobasal medium	Life Technologies	21103-049	Protect from light
B27 supplement	Life Technologies	17504-044	aliquot, store in 0.6ml size
GlutaMAX-I	Life Technologies	35050-061	dilute 100X
antibiotic-antimycotic (AA)	Life Technologies	15240-096	dilute 100X
Complete Culture medium			Neurobasal medium with 1X B27, 1X AA, 1X GlutaMAX-I
Wash medium			same as 'Neurobasal medium'
Feed medium			Neurobasal with 1X B27 supplement
DNAse I	Sigma-Aldrich	D5025	prepare 100X stock at 0.6mg/ml
poly-D-lysine	Sigma-Aldrich	P6407	M.W. 70000-150000
borate buffer	Sigma-Aldrich	B6768 (boric acid); 71997(borax)	1.24g boric acid & 1.9g borax in 400ml H2O, pH to 8.5 use HCl
12-mm round glass coverslips	Glasswarenfabrik Karl Hecht GmbH	1001/12	No. 1 glass, purchase from Carolina Biological Supply
proFection transfection kit	Promega	E1200	see  protocol for details
2X HEPES buffered saline (HBS)	Promega	E1200	see  protocol for details
Syringe filter	Pall Corporation	4192	0.2um pore size
Endofree plasmid prep kit	Qiagen	12362	for preparation of transfection grade plasmid DNA
anti-MAP2 antibody	Millipore	MAB3418	mouse antibody, clone AP20
anti-p-Tau antibody	Millipore	AB10417	rabbit polyclonal antibody
anti-NR1 antibody	Millipore	MAB1586	mouse antibody, clone R1JHL
anti-GluR1 antibody	Millipore	AB1504	rabbit polyclonal antibody
Hank's balanced salt solution	ThermoFisher	14025092	500ml size