En forenklet metode til Ultra Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Kultur

Summary

Low density cultures of primary hippocampal neurons usually require glia feeder layer to supply neurotrophic factors and sustain longevity. We describe here a simplified method to culture ultra-low density neurons on glass coverslips in the presence of a high density neuronal feeder layer, which facilitates investigation of specific neuronal-autonomous mechanisms.

Abstract

Dyrkning primære hippocampus neuroner in vitro letter mekanistisk forhør af mange aspekter af neuronal udvikling. Dissocierede embryoniske hippocampale neuroner kan ofte vokse med held på dækglas ved høj tæthed under serumfrie betingelser, men kulturer med lav densitet typisk kræve en levering af trofiske faktorer ved co-dyrkning af dem med en glia fødelag, fremstilling der kan være tidskrævende og arbejdskrævende. Desuden kan tilstedeværelsen af ​​glia forvirre fortolkning af resultaterne og undgå undersøgelser af neuron-specifikke mekanismer. Her er en forenklet metode præsenteret for ultra-low density (~ 2.000 neuroner / ^cm2), langsigtet (> 3 måneder) primær hippocampus neuron kultur, der er under serumfri betingelser og uden glia celle støtte. neuroner lav densitet er dyrket på poly-D-lysin overtrukne dækglas, og vendt på høje neuroner massefylde dyrket i en plade med 24 brønde. Stedet for at bruge paraffin prikker til at skabe et rum between de to neuronale lag, kan eksperimentatorer simpelthen ætse plast bunden af ​​brønden, hvor de høje neuroner densitet bor, for at skabe en microspace befordrende for lav densitet neuron vækst. Co-kultur kan let opretholdes i> 3 måneder uden signifikant tab af neuroner lav densitet, hvilket vil lette den morfologiske og fysiologiske studier af disse neuroner. For at illustrere dette vellykkede kultur tilstand, er data leveres for at vise kraftig synapse dannelse i celler med lav massefylde efter længere tids kultur. Denne co-kultur-system letter også overlevelsen af ​​sparsomme individuelle neuroner dyrket i øer af poly-D-lysin substrater og dermed dannelsen af ​​autaptic forbindelser.

Introduction

Voksende hippocampale neuroner under in vitro betingelser muliggør observation og eksperimentel manipulation af disse neuroner, som ellers ikke er muligt in vivo. Denne eksperimentelle fremgangsmåde er almindeligt anvendt til at afsløre neuronale mekanismer vækst, polaritet, neurit specifikation, menneskehandel og subcellulære lokalisering af proteiner, synapse dannelse og funktionelle modning ^1. Disse in vitro dyrkede hippocampale neuroner, når de er høstet fra sent embryonale stadier, er relativt rent (> 90%) glutamaterge celler af pyramideformede morfologi ^2. Fordi neuroner blev dyrket i en 2-D overflade under in vitro betingelser, denne metode giver let observation, såsom levende billeddannelse eller immuncytokemi (ICC) farvning gennem en enkelt brændplan ^3; eller manipulationer, såsom narkotika behandling og transfektioner ^3-6. Når der dyrkes ved høj tæthed, neuroner tendens til at have høje overlevelse på grund af højere concentrations af udskilt vækstfaktorer foruden ernæringsmæssig støtte fra vækstmedierne, og også på grund af neurit kontakt-afhængige mekanismer ^7. Men lav densitet hippocampusneuroner er ønskelige for morfologiske studier, hvor en person neuron kan afbildes i sin helhed eller farvet for ICC analyse. Neuroner lav tæthed er svære at opretholde i kultur på grund af manglende parakrine støtte og derfor ofte kræver trofisk støtte fra en glial (typisk cortical astrocyt) fødelag, som skal fremstilles før neuron kultur ^2. Når co-dyrket med en glial celle fødelag, er neuroner lav massefylde dyrket på dækglas, og derefter spejlvendt på toppen af ​​glia lag, således at de lave neuroner massefylde og glia er rettet mod hinanden. En lille lukket rum mellem glia og neuroner er skabt ved at placere paraffin voks prikker på hjørnerne af dækglas, derfor skabe en »sandwich« layout ^2,8,9. Neuronerne lav densitet vil vokse wnden for begrænset plads mellem glia og dækglasset, hvilket skaber en permissiv mikromiljø med koncentrerede faktorer der udskilles af neuroner og glia. Denne tilgang giver lav densitet, fuldt udviklede neuroner, der er fordelt rimeligt fra hinanden, derfor lette ICC mærkning eller levende billeddiagnostiske undersøgelser.

En tilsyneladende ulempe ved neuron-glia co-kultur, bortset fra at være tidskrævende og arbejdskrævende, er, at den forhindrer undersøgelse af neuron-specifik eller celle-autonom, mekanismer. Selv om dette system er langt mindre kompleks end in vivo neuralt væv, glia indvirkning på neuron udvikling gennem secernerede, endnu-ikke-fuldt definerede faktorer kan forvirre eksperimenterne ^10. Derfor, i eksperimenter, der kræver undersøgelse af neuron specifikke mekanismer, definerede dyrkningsbetingelser der fjerner serum og glial støttelag er nødvendige. En tidligere undersøgelse er lykkedes dyrkning lave koncentrationer af neuroner (~ 9.000 celler / ^cm2) ved anvendelse af en three dimensionelle hydrogel matrix ^11. Da en relativt ren neuronal population kan dyrkes ved høj densitet under serumfri betingelser uden glial støtte, vi hypotesen, at ultralav densitet af hippocampale neuroner kan dyrkes i serumfrit defineret dyrkningsmedium ved co-dyrkning deraf med højt neuroner densitet, i en måde, der er analog med konventionelt vedtaget neuron-glia co-kultur. Faktisk høj densitet hippocampale neuron kulturer i en "sandwich" konfiguration er blevet for nylig anvendt til at støtte et lille antal specialiserede magnocellulære endokrine neuroner ^12.

Derfor kan co-kultur med høje neuroner densitet tillader neuroner lav densitet til at modtage trofisk faktorer støtte, der er tilstrækkelig til, at langtidsoverlevelse. Denne protokol af dyrkning af ultra-low density neuroner blev således formuleret og valideret. Protokollen kan implementeres inden for et enkelt forsøg, ved at forberede høj densitet (~ 250.000 celler / ml) disknyttede hippocampale neuroner først, og derefter gør en fortynding til opnåelse af en tæthed ~ 10.000 neuroner / ml (~ 3.000 neuroner / dækglas, eller ~ 2.000 neuroner / ^cm2), som er meget lavere end de fleste rapporterede kulturer med lav massefylde ^{2,3,9 , 11,13.} Denne kultur betingelse er løst benævnt "ultra-low density 'kultur og bruges med' low-density" inter-changeably. De høje neuroner densitet udplades på poly-D-lysin-coatede 24-brønds plader; mens neuronerne lav densitet podes på poly-D-lysin overtrukne 12-mm dækglas, der er placeret inden i en anden 24-brønds plade. Dækglassene med vedhængende neuroner lav massefylde er vendt på toppen af ​​de høje neuroner densitet 2 timer senere efter neuronerne nedstammer og fastgjort til dækglassene. Desuden, i stedet for at bruge paraffin voks prikker til at løfte dækglassene over høj densitet neuron lag blev en 18 G kanyle bruges til at ætse bunden af ​​pladerne med 24 brønde med to parallelle striber. Den resulterende DISPLAced, tilstødende plast giver en forhøjet støtte til dækglas. Dette rum er konsekvent måles ved 150-200 um, der tillader tilstrækkelig ilt og dyrkningsmedium udveksling samtidig sikre et mikromiljø med koncentrerede trofiske faktorer. Under denne betingelse, de lave neuroner densitet vokse ekstensivt, og kan overleve over tre måneder i kultur. Når disse neuroner transficeres med GFP plasmid efter tre uger i kultur, er dendritter rigt besat med dendritiske spidser. Som et bevis på princippet, er data præsenteret for at vise, at dette samarbejde kultur system understøtter kulturer ultra-lav densitet af hippocampus neuroner podet på poly-D-lysin 'mikro-øer ", hvor neuroner danner autaptic forbindelser, der kan lette undersøgelse af celle Den selvstændige, netværk-uafhængige mekanismer.

Protocol

Alle eksperimentelle procedurer, der involverer mus blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg fra University of Arizona, og var i overensstemmelse med NIH retningslinjer. 1. vævskilde for Hippocampal Neuron Kultur For at generere prænatal mus hvalpe til hippocampus neuron kultur, bruge tid-gravide mus (C57BL6 / J), der er opdrættet i hus 17. Dagen med vaginal prop detektion er udpeget som E0.5. Den planlagte høsttidspunkt for kultur er E16.5-E17.5. <…

Representative Results

Protokollen beskrevet her muliggør vellykket ultralav densitet, langtidsdyrkning af rene glutamaterge neuroner uden behov for gliaceller, der tjener som et fødelag. Protokollen er et diagram i figur 1, som involverer fremstilling af høj densitet (på poly-D-lysin overtrukne 24 brønde) og low-density neuroner (på poly-D-lysin-overtrukne dækglas) separat, og efterfølgende co-kultur, der kan opretholdes op til tre måneder. <p class="jove_content" fo:keep-togethe…

Discussion

Vi præsenterer en detaljeret protokol for langsigtet kultur af ultra-low density hippocampus glutamaterge neuroner under serumfri betingelser. På ~ 2000 neuroner / ^cm2, tætheden er mindst to gange lavere end de fleste "lav tæthed 'kultur præparater med eller uden glia støtte rapporteret af den eksisterende litteratur ^{2,3,11,13,14.} Ud over at være ultra-lav densitet, denne protokol er hidtil ukendt og vigtig i yderligere to måder. Først er ingen glia fødelag nødvendig som de lave…

Materials

Neurobasal medium	Life Technologies	21103-049	Protect from light
B27 supplement	Life Technologies	17504-044	aliquot, store in 0.6ml size
GlutaMAX-I	Life Technologies	35050-061	dilute 100X
antibiotic-antimycotic (AA)	Life Technologies	15240-096	dilute 100X
Complete Culture medium			Neurobasal medium with 1X B27, 1X AA, 1X GlutaMAX-I
Wash medium			same as 'Neurobasal medium'
Feed medium			Neurobasal with 1X B27 supplement
DNAse I	Sigma-Aldrich	D5025	prepare 100X stock at 0.6mg/ml
poly-D-lysine	Sigma-Aldrich	P6407	M.W. 70000-150000
borate buffer	Sigma-Aldrich	B6768 (boric acid); 71997(borax)	1.24g boric acid & 1.9g borax in 400ml H2O, pH to 8.5 use HCl
12-mm round glass coverslips	Glasswarenfabrik Karl Hecht GmbH	1001/12	No. 1 glass, purchase from Carolina Biological Supply
proFection transfection kit	Promega	E1200	see  protocol for details
2X HEPES buffered saline (HBS)	Promega	E1200	see  protocol for details
Syringe filter	Pall Corporation	4192	0.2um pore size
Endofree plasmid prep kit	Qiagen	12362	for preparation of transfection grade plasmid DNA
anti-MAP2 antibody	Millipore	MAB3418	mouse antibody, clone AP20
anti-p-Tau antibody	Millipore	AB10417	rabbit polyclonal antibody
anti-NR1 antibody	Millipore	MAB1586	mouse antibody, clone R1JHL
anti-GluR1 antibody	Millipore	AB1504	rabbit polyclonal antibody
Hank's balanced salt solution	ThermoFisher	14025092	500ml size