अल्ट्रा कम घनत्व के लिए एक सरल विधि, लंबी अवधि के प्राथमिक हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन संस्कृति
Summary
Low density cultures of primary hippocampal neurons usually require glia feeder layer to supply neurotrophic factors and sustain longevity. We describe here a simplified method to culture ultra-low density neurons on glass coverslips in the presence of a high density neuronal feeder layer, which facilitates investigation of specific neuronal-autonomous mechanisms.
Abstract
इन विट्रो में प्राथमिक hippocampal न्यूरॉन्स संवर्धन न्यूरोनल विकास के कई पहलुओं की यंत्रवत पूछताछ की सुविधा। अलग भ्रूण hippocampal न्यूरॉन्स अक्सर सीरम मुक्त शर्तों के तहत उच्च घनत्व में कांच coverslips पर सफलतापूर्वक विकसित कर सकते हैं, लेकिन आम तौर पर कम घनत्व संस्कृतियों से पौष्टिकता संबंधी कारकों में से एक की आपूर्ति की आवश्यकता है उन्हें एक glia फीडर परत, जो तैयारी के समय लेने वाली हो सकता है के साथ सह संवर्धन और श्रमसाध्य। इसके अलावा, glia की उपस्थिति परिणाम और न्यूरॉन विशिष्ट तंत्र पर रोकना अध्ययन की व्याख्या उलझाना सकता है। इधर, एक सरल विधि अल्ट्रा कम घनत्व (~ 2,000 न्यूरॉन्स / 2 सेमी), लंबी अवधि (> 3 महीने) प्राथमिक हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन संस्कृति है कि सीरम मुक्त शर्तों के तहत और glia सेल समर्थन के बिना के लिए प्रस्तुत किया है। कम घनत्व न्यूरॉन्स पाली डी lysine लेपित coverslips पर हो, और उच्च घनत्व 24 अच्छी तरह से थाली में उगाया न्यूरॉन्स पर फ़्लिप हैं। इसके बजाय betwee एक जगह बनाने के लिए पैराफिन डॉट्स का उपयोग करने काn दो न्यूरोनल परतों, प्रयोगकर्ताओं बस अच्छी तरह से प्लास्टिक के नीचे है, जिस पर उच्च घनत्व न्यूरॉन्स रहते एक microspace कम घनत्व न्यूरॉन विकास के लिए अनुकूल बनाने के लिए खोदना कर सकते हैं। सह संस्कृति को आसानी से कम घनत्व न्यूरॉन्स की महत्वपूर्ण नुकसान के बिना> 3 महीने के लिए बनाए रखा जा सकता है, इस प्रकार इन न्यूरॉन्स की रूपात्मक और शारीरिक अध्ययन की सुविधा। इस सफल संस्कृति हालत उदाहरण देकर स्पष्ट करने के लिए, डेटा लंबे समय तक संस्कृति के बाद कम घनत्व कोशिकाओं में विपुल synapse गठन को दिखाने के लिए प्रदान की जाती हैं। इस प्रणाली सह संस्कृति भी विरल व्यक्ति पाली डी lysine substrates और इस प्रकार autaptic कनेक्शन के गठन के द्वीपों में उगाया न्यूरॉन्स के अस्तित्व की सुविधा।
Introduction
इन विट्रो की शर्तों के तहत hippocampal न्यूरॉन्स बढ़ते अवलोकन और इन न्यूरॉन्स कि अन्यथा विवो में संभव नहीं हैं की प्रयोगात्मक हेरफेर सक्षम बनाता है। इस प्रयोगात्मक दृष्टिकोण व्यापक रूप से विकास, polarity, neurite विनिर्देश, तस्करी और प्रोटीन की subcellular स्थानीयकरण, synapse गठन और कार्यात्मक परिपक्वता 1 के neuronal तंत्र प्रकट करने के लिए प्रयोग किया जाता है। इन विट्रो में संवर्धित hippocampal न्यूरॉन्स, जब देर से भ्रूण चरणों से काटा, अपेक्षाकृत शुद्ध पिरामिड आकृति विज्ञान के 2 (> 90%) ग्लूटामेटरगिक कोशिकाओं रहे हैं। क्योंकि न्यूरॉन्स इन विट्रो परिस्थितियों में एक 2-डी सतह में बड़े हो रहे थे, इस विधि इस तरह के लाइव इमेजिंग या immunocytochemistry (आईसीसी) के रूप में आसान अवलोकन की अनुमति देता है एक ही फोकल हवाई जहाज़ से 3 को धुंधला हो जाना; या ऐसी दवा उपचार और transfections 3-6 के रूप में जोड़तोड़। जब उच्च घनत्व में वृद्धि हुई, न्यूरॉन्स उच्च सह अस्तित्व की उच्च दर की वजह से हो जाते हैंविकास मीडिया से, और भी neurite संपर्क-निर्भर तंत्र 7 की वजह से पाचन समर्थन के अलावा में secreted वृद्धि कारकों की ncentrations। हालांकि, कम घनत्व hippocampal न्यूरॉन्स रूपात्मक अध्ययन, जहां एक व्यक्ति न्यूरॉन अपनी संपूर्णता में imaged किया जा सकता है या आईसीसी के विश्लेषण के लिए दाग के लिए वांछित हैं। कम घनत्व न्यूरॉन्स पैराक्राइन समर्थन की कमी के कारण संस्कृति में बनाए रखने के लिए मेहनत कर रहे हैं और इस प्रकार अक्सर एक glial (आमतौर पर cortical astrocyte) फीडर परत है, जो न्यूरॉन संस्कृति 2 से पहले तैयार हो गया है पौष्टिकता से समर्थन की आवश्यकता है। जब सह-सुसंस्कृत एक glial सेल फीडर परत के साथ, कम घनत्व न्यूरॉन्स coverslips पर बड़े हो रहे हैं, और फिर glia परत के शीर्ष पर फ़्लिप किया है, ताकि कम घनत्व न्यूरॉन्स और glia एक दूसरे का सामना कर रहे हैं। Glia और न्यूरॉन्स के बीच एक छोटा सा सीमित स्थान coverslips के कोनों पर पैराफिन मोम डॉट्स रखने, इसलिए एक 'सैंडविच' लेआउट 2,8,9 बनाने के द्वारा बनाई गई है। कम घनत्व न्यूरॉन्स डब्ल्यू विकसित होगाglia और coverslip, जो न्यूरॉन्स और glia द्वारा स्रावित केंद्रित कारकों के साथ एक अनुमोदक microenvironment बनाता बीच सीमित स्थान Ithin। यह दृष्टिकोण कम घनत्व, पूरी तरह से विकसित न्यूरॉन्स कि यथोचित अलग स्थान है, इसलिए आईसीसी की सुविधा लेबलिंग या लाइव इमेजिंग अध्ययन अर्जित करता है।
न्यूरॉन glia सह संस्कृति का एक स्पष्ट दोष यह है, एक तरफ समय लेने वाली और श्रमसाध्य जा रहा है, कि यह न्यूरॉन विशिष्ट, या सेल स्वायत्त तंत्र के अध्ययन से बचाता है। हालांकि इस प्रणाली में अब तक कम से कम जटिल है विवो तंत्रिका ऊतक, स्रावित, नहीं, अभी तक पूरी तरह से परिभाषित कारकों के माध्यम से न्यूरॉन विकास पर प्रभाव glia प्रयोगों 10 उलझाना कर सकते हैं। इसलिए, प्रयोगों कि न्यूरॉन विशिष्ट तंत्र की जांच, परिभाषित संस्कृति की स्थिति को दूर सीरम और glial समर्थन परत जरूरी हैं की आवश्यकता होती है। पिछले एक अध्ययन न्यूरॉन्स की कम मात्रा (~ 9000 कोशिकाओं / 2 सेमी) एक वें का उपयोग कर संवर्धन में सफल रहा हैREE आयामी हाइड्रोजेल मैट्रिक्स 11। चूंकि एक अपेक्षाकृत शुद्ध न्यूरोनल जनसंख्या glial समर्थन के बिना सीरम मुक्त शर्तों के तहत उच्च घनत्व में संवर्धित किया जा सकता है, हम परिकल्पना है कि hippocampal न्यूरॉन्स की अल्ट्रा कम घनत्व से सीरम मुक्त परिभाषित संस्कृति के माध्यम में उगाया जा सकता है उन्हें उच्च घनत्व न्यूरॉन्स के साथ सह संवर्धन में एक तरीका है कि पारंपरिक अपनाया न्यूरॉन glia सह संस्कृति के अनुरूप है। दरअसल, एक 'सैंडविच' विन्यास में उच्च घनत्व हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन संस्कृतियों हाल ही में अंत: स्रावी magnocellular न्यूरॉन्स 12 विशेष की एक छोटी संख्या का समर्थन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है।
इसलिए, उच्च घनत्व न्यूरॉन्स के साथ सह संस्कृति कम घनत्व न्यूरॉन्स पौष्टिकता संबंधी कारकों समर्थन है कि लंबे समय तक जीवित रहने के लिए सक्षम करने के लिए पर्याप्त है प्राप्त करने की अनुमति हो सकती है। संवर्धन अल्ट्रा कम घनत्व न्यूरॉन्स की इस प्रोटोकॉल इस प्रकार तैयार की है और मान्य किया गया था। प्रोटोकॉल, एक ही प्रयोग के भीतर लागू किया जा सकता उच्च घनत्व तैयार करके (~ 250,000 कोशिकाओं / एमएल) जिलेsociated hippocampal न्यूरॉन्स पहले, और फिर एक घनत्व ~ 10,000 न्यूरॉन्स उपज के लिए एक कमजोर पड़ने बनाने / एमएल (~ 3,000 न्यूरॉन्स / coverslip, या ~ 2,000 न्यूरॉन्स / 2 सेमी) है, जो बहुत कम की तुलना में सबसे कम घनत्व संस्कृतियों की सूचना दी है 2,3,9 , 11,13। इस संस्कृति हालत शिथिल 'अल्ट्रा कम घनत्व' संस्कृति के रूप में करने के लिए भेजा और 'कम-घनत्व' अंतर-changeably के साथ प्रयोग किया जाता है। उच्च घनत्व न्यूरॉन्स पाली डी lysine लेपित 24 अच्छी तरह से प्लेटों पर चढ़ाया जाता है; जबकि कम घनत्व न्यूरॉन्स पाली डी lysine लेपित 12 मिमी कांच coverslips पर वरीयता प्राप्त कर रहे हैं एक और 24 अच्छी तरह से थाली के अंदर रखा जाता है। कम घनत्व न्यूरॉन्स पालन करने के साथ coverslips 2 घंटा बाद में उच्च घनत्व न्यूरॉन्स के शीर्ष पर फ़्लिप हैं न्यूरॉन्स के बाद उतरा और coverslips से जुड़े होते हैं। इसके अलावा, बजाय उच्च घनत्व न्यूरॉन परत के ऊपर coverslips तरक्की के लिए पैराफिन मोम डॉट्स का उपयोग कर के, एक 18 जी सिरिंज सुई दो समानांतर धारियों के साथ 24 अच्छी तरह से प्लेट के नीचे खोदना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। जिसके परिणामस्वरूप displAced, आसपास के प्लास्टिक गिलास coverslips के लिए एक ऊंचा समर्थन प्रदान करते हैं। इस अंतरिक्ष लगातार 150-200 माइक्रोन, जो पर्याप्त ऑक्सीजन और संस्कृति के माध्यम से आदान-प्रदान की अनुमति देता है, जबकि केंद्रित पौष्टिकता संबंधी कारकों के साथ एक microenvironment उपलब्ध कराने पर मापा जाता है। इस शर्त के तहत, कम घनत्व न्यूरॉन्स बड़े पैमाने पर हो जाना, और संस्कृति में तीन महीने से परे जीवित रह सकते हैं। इन न्यूरॉन्स संस्कृति में तीन सप्ताह के बाद GFP प्लाज्मिड के साथ ट्रांसफ़ेक्ट कर रहे हैं, डेन्ड्राइट दरियादिली से वृक्ष के समान कांटा के साथ जड़ी हैं। सिद्धांत का एक सबूत के रूप में, डेटा है कि इस प्रणाली सह संस्कृति पाली-D-लाइसिन 'सूक्ष्म द्वीप' है, जहां न्यूरॉन्स autaptic कनेक्शन है कि सेल की जांच की सुविधा हो सकती फार्म पर वरीयता प्राप्त hippocampal न्यूरॉन्स की अल्ट्रा कम घनत्व संस्कृतियों का समर्थन दिखाने के लिए प्रस्तुत कर रहे हैं -autonomous, नेटवर्क स्वतंत्र तंत्र।
Protocol
Representative Results
Discussion
हम सीरम मुक्त शर्तों के तहत अल्ट्रा कम घनत्व हिप्पोकैम्पस ग्लूटामेटरगिक न्यूरॉन्स की लंबी अवधि संस्कृति के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल उपस्थित थे। पर ~ 2000 न्यूरॉन्स / 2 सेमी, घनत्व के साथ या glia समर्थन म?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by an NIH/NIMH grant to S.Q. (R00MH087628).
Materials
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | Protect from light |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | aliquot, store in 0.6ml size |
| GlutaMAX-I | Life Technologies | 35050-061 | dilute 100X |
| antibiotic-antimycotic (AA) | Life Technologies | 15240-096 | dilute 100X |
| Complete Culture medium | Neurobasal medium with 1X B27, 1X AA, 1X GlutaMAX-I | ||
| Wash medium | same as 'Neurobasal medium' | ||
| Feed medium | Neurobasal with 1X B27 supplement | ||
| DNAse I | Sigma-Aldrich | D5025 | prepare 100X stock at 0.6mg/ml |
| poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | M.W. 70000-150000 |
| borate buffer | Sigma-Aldrich | B6768 (boric acid); 71997(borax) | 1.24g boric acid & 1.9g borax in 400ml H2O, pH to 8.5 use HCl |
| 12-mm round glass coverslips | Glasswarenfabrik Karl Hecht GmbH | 1001/12 | No. 1 glass, purchase from Carolina Biological Supply |
| proFection transfection kit | Promega | E1200 | see protocol for details |
| 2X HEPES buffered saline (HBS) | Promega | E1200 | see protocol for details |
| Syringe filter | Pall Corporation | 4192 | 0.2um pore size |
| Endofree plasmid prep kit | Qiagen | 12362 | for preparation of transfection grade plasmid DNA |
| anti-MAP2 antibody | Millipore | MAB3418 | mouse antibody, clone AP20 |
| anti-p-Tau antibody | Millipore | AB10417 | rabbit polyclonal antibody |
| anti-NR1 antibody | Millipore | MAB1586 | mouse antibody, clone R1JHL |
| anti-GluR1 antibody | Millipore | AB1504 | rabbit polyclonal antibody |
| Hank's balanced salt solution | ThermoFisher | 14025092 | 500ml size |
Referências
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