En forenklet metode for Ultra-Low Density, Long-Term Primær hippocampus Neuron Kultur

Summary

Low density cultures of primary hippocampal neurons usually require glia feeder layer to supply neurotrophic factors and sustain longevity. We describe here a simplified method to culture ultra-low density neurons on glass coverslips in the presence of a high density neuronal feeder layer, which facilitates investigation of specific neuronal-autonomous mechanisms.

Abstract

Dyrking primære hippocampus nevroner in vitro letter mekanistisk avhør av mange aspekter av neuronal utvikling. Dissosierte embryoniske hippocampale neuroner kan ofte vokse med hell på dekkglass ved høy tetthet under serumfrie betingelser, men kulturer med lav tetthet vanligvis krever en tilførsel av trofiske faktorer ved ko-dyrking av dem med en gliaceller mater lag, fremstilling av disse kan være tidkrevende og arbeidskrevende. I tillegg kan tilstedeværelsen av gliaceller forvirre tolkning av resultater og være til hinder for studier av neuron-spesifikke mekanismer. Her er en forenklet fremgangsmåte presentert for ultra-lav densitet (~ 2000 neuroner / cm ^2), lang sikt (> 3 måneder) primære hippocampale nervecelle kultur som er under serumfrie forhold og uten glia celle støtte. tetthet neuroner lave dyrkes på poly-D-lysin-belagte dekkglass, og vendt på nerveceller med høy tetthet dyrket i en 24-brønns plate. I stedet for å bruke parafin punkter for å skape et mellomrom between de to nevrale lag, kan forskere bare etse plast bunnen av brønnen, på hvilke de høye neuroner tetthet bor, for å skape en MICRO bidrar til neuronvekst lav tetthet. Den ko-kulturen kan lett opprettholdes i> 3 måneder uten betydelig tap av neuroner lav densitet, noe som letter den morfologiske og fysiologiske studium av disse neuroner. For å illustrere dette vellykket kulturen tilstand, data gitt for å vise rikelig synapse formasjonen i cellene lav tetthet etter langvarig kultur. Dette co-kultur system forenkler også overlevelsen av spredte enkeltnerveceller dyrket i øyene i poly-D-lysin underlag og dermed dannelsen av autaptic tilkoblinger.

Introduction

Økende hippocampus-neuroner under in vitro betingelser muliggjør observasjon og eksperimentell manipulasjon av disse neuroner som ellers ikke er mulig in vivo. Dette eksperimentell tilnærming er mye brukt for å avsløre nevronale mekanismer for vekst, polaritet, neuritt-spesifikasjon, handel og subcellulær lokalisering av proteiner, synapse formasjon og funksjonell modning ^1. Disse in vitro-dyrkede hippocampale neuroner, når høstet fra sene embryonale stadier, er forholdsvis rent (> 90%) glutamaterge celler av pyramideformet morfologi ^2. Fordi neuroner ble dyrket i en 2-D overflate under in vitro-betingelser, gir denne metode lett observasjon, slik som levende avbildning eller immunocytokjemi (ICC) farging gjennom et enkelt fokusplanet ^3; eller manipulasjoner, som medikamentell behandling og trans ^3-6. Når vokst med høy tetthet, nevroner tendens til å ha høy forekomst av overlevelse på grunn av høyere concentrations av utskilt vekstfaktorer i tillegg til næringsmiddel støtte fra vekstmediet, og også på grunn av neurite kontaktavhengige mekanismer ^7. Imidlertid lav densitet hippocampale neuroner er ønskelige for morfologiske studier, hvor en enkelt neuron kan avbildes i sin helhet eller farget for ICC analyse. Tetthet neuroner lav er vanskelig å opprettholde i kultur grunn av manglende støtte parakrin og således krever ofte trofisk støtte fra en glial (typisk kortikale astrocytt) mater lag, som må fremstilles før neuron kultur ^2. Når ko-dyrket med en glial cellemater lag, blir neuroner lav tetthet dyrket på dekkglass, og deretter snudd på toppen av gliaceller lag slik at neuroner og glia lav densitet er vendt mot hverandre. En liten begrenset plass mellom gliaceller og nevroner er skapt ved å plassere parafinvoks prikker på hjørnene av dekkglass, derfor skape en "sandwich layout ^2,8,9. Nervecellene lav tetthet vil vokse wTVen på det trange rommet mellom gliaceller og dekkglass, som skaper en ettergivende mikromiljøet med konsentrerte faktorer utskilles av nevroner og gliaceller. Denne tilnærmingen gir lav tetthet, fullt utviklede nevroner som er fordelt rimelig hverandre, derfor legge til rette for ICC merking eller levende bildediagnostikk.

En åpenbar ulempe med neuron-glia ko-kultur, bortsett fra å være tidkrevende og arbeidskrevende, er at det hindrer studie av neuron-spesifikke, eller celle-autonome, mekanismer. Selv om dette systemet er langt mindre komplisert enn in vivo nevrale vev, gliaceller innvirkning på neuron utvikling gjennom utskilt, ikke-ennå-fullt-definerte faktorer kan forvirre forsøkene ^10. Derfor, i eksperimenter som krever undersøkelse av nervecellen spesifikke mekanismer, definerte dyrkningsbetingelser som fjerner serum og glial bærersjikt er nødvendige. En tidligere studie har lykkes i å dyrke lave konsentrasjoner av nerveceller (~ 9000 celler / cm ²⁾ ved hjelp av en three dimensjonal hydrogel matrise ^11. Siden et relativt rent neuronal populasjon kan bli dyrket til høy tetthet i henhold til serum-frie betingelser uten glial støtte, hypoteser om vi at ultra-lav tetthet av hippokampale neuroner kan bli dyrket i serumfritt definert kulturmedium ved ko-dyrking av dem med nerveceller med høy tetthet, i en måte som er analog med den konvensjonelt innført neuron-glia ko-kulturen. Faktisk har høy tetthet hippocampus nevronkulturer i en "sandwich konfigurasjon nylig blitt brukt til å støtte et lite antall spesialiserte magnocellular endokrine nevroner ^12.

Derfor kan ko-kultur med nevroner høy tetthet tillate nerveceller med lav tetthet for å motta trofiske faktorer støtte som er tilstrekkelig for å muliggjøre langvarig overlevelse. Denne protokollen av dyrknings nevroner ultra-low density ble dermed formulert og validert. Protokollen kan gjennomføres innenfor en enkelt eksperiment, ved å fremstille med høy tetthet (~ 250.000 celler / ml) disassosieres hippocampale neuroner først, og deretter å lage en fortynning for å gi en tetthet ~ 10000 neuroner / ml (~ 3000 neuroner / dekkglass, eller ~ 2000 neuroner / cm ^2), som er mye lavere enn de rapportert lav tetthet kulturer ^{2,3,9 , 11,13.} Denne kulturen tilstanden er løst referert til som "ultra-low density" kultur og brukes med "low-density" inter-changeably. Neuronene med høy tetthet blir sådd ut på poly-D-lysin-belagte 24-brønners plater; mens neuronene lav densitet blir sådd ut på poly-D-lysin-belagte 12 mm dekkglass som er plassert inne i en annen 24-brønns plate. Glassene med holde tetthet nevroner lave snudd på toppen av nevroner høy tetthet 2 timer senere etter nervecellene stammer og festet til Dekk. I tillegg, i stedet for å bruke parafinvoks punkter for å heve glassene over høy tetthet neuron lag, ble en 18 G nål sprøyte som brukes for å etse bunnen av de 24 brønners plater med to parallelle striper. Den resulterende displAced, tilstøtende plast gir en forhøyet støtte for dekkglass. Denne plassen er konsekvent målt ved 150-200 nm, noe som gir tilstrekkelig oksygen og dyrkingsmedium utveksling samtidig som det gir en mikromiljøet med konsentrerte trofiske faktorer. Under denne tilstanden, nervecellene lav tetthet vokse mye, og kan overleve utover tre måneder i kultur. Når disse nevronene blir tilført med GFP plasmid etter tre uker i kultur, er dendritter voldsomt besatt med dendrittutløperne. Som et bevis på prinsipp, blir data presentert for å vise at dette samarbeidet kultur Systemet støtter tetthet kulturer av hippocampus nevroner seeded på poly-D-lysin 'mikro-øyenes, hvor nervecellene danner autaptic forbindelser som kan fremme undersøkelse av celle ultra-lav -autonomous, nettverksuavhengig mekanismer.

Protocol

Alle eksperimentelle prosedyrer som involverer mus ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of Arizona, og likedannet NIH retningslinjer. 1. Tissue kilde for hippocampus Neuron Kultur For å generere prenatal museunger for hippocampus nevron kultur, bruke tids drektige mus (C57BL6 / J) som er avlet i huset 17. Dagen med vaginal plug påvisning er utpekt som E0.5. Den planlagte innhøstingen for kultur er E16.5-E17.5. Merk: Denne pr…

Representative Results

Protokollen er beskrevet her gjør det mulig for vellykket ultra-lav tetthet, langtidskultur av rene glutamaterge nevroner uten behov av gliaceller som tjener som et matersjikt. Protokollen er diagramed i figur 1, som innbefatter fremstilling av høy tetthet (på poly-D-lysin-belagte 24 brønner) og lav tetthet nevroner (på poly-D-lysin-belagte dekkglass) hver for seg, og etterfølgende ko-kultur som kan opprettholdes inntil tre måneder. <p class="jove_content" fo:…

Discussion

Vi presenterer en detaljert protokoll for langsiktig kultur for ultra-low density hippocampus glutamaterge nevroner i henhold til serumfrie forhold. På ~ 2000 neuroner / cm ^2, er tettheten i det minste to ganger lavere enn de fleste "lav tetthet" kultur-preparater, med eller uten glia støtte rapportert av eksisterende litteratur ^{2,3,11,13,14.} I tillegg til å være ultra-lav tetthet, er denne protokollen ny og vesentlig i to måter. For det første er det ikke glia matersjikt nødvendig…

Materials

Neurobasal medium	Life Technologies	21103-049	Protect from light
B27 supplement	Life Technologies	17504-044	aliquot, store in 0.6ml size
GlutaMAX-I	Life Technologies	35050-061	dilute 100X
antibiotic-antimycotic (AA)	Life Technologies	15240-096	dilute 100X
Complete Culture medium			Neurobasal medium with 1X B27, 1X AA, 1X GlutaMAX-I
Wash medium			same as 'Neurobasal medium'
Feed medium			Neurobasal with 1X B27 supplement
DNAse I	Sigma-Aldrich	D5025	prepare 100X stock at 0.6mg/ml
poly-D-lysine	Sigma-Aldrich	P6407	M.W. 70000-150000
borate buffer	Sigma-Aldrich	B6768 (boric acid); 71997(borax)	1.24g boric acid & 1.9g borax in 400ml H2O, pH to 8.5 use HCl
12-mm round glass coverslips	Glasswarenfabrik Karl Hecht GmbH	1001/12	No. 1 glass, purchase from Carolina Biological Supply
proFection transfection kit	Promega	E1200	see  protocol for details
2X HEPES buffered saline (HBS)	Promega	E1200	see  protocol for details
Syringe filter	Pall Corporation	4192	0.2um pore size
Endofree plasmid prep kit	Qiagen	12362	for preparation of transfection grade plasmid DNA
anti-MAP2 antibody	Millipore	MAB3418	mouse antibody, clone AP20
anti-p-Tau antibody	Millipore	AB10417	rabbit polyclonal antibody
anti-NR1 antibody	Millipore	MAB1586	mouse antibody, clone R1JHL
anti-GluR1 antibody	Millipore	AB1504	rabbit polyclonal antibody
Hank's balanced salt solution	ThermoFisher	14025092	500ml size