Un método simplificado para determinar la densidad ultra-baja, a largo plazo del hipocampo primaria Neurona Cultura

Summary

Low density cultures of primary hippocampal neurons usually require glia feeder layer to supply neurotrophic factors and sustain longevity. We describe here a simplified method to culture ultra-low density neurons on glass coverslips in the presence of a high density neuronal feeder layer, which facilitates investigation of specific neuronal-autonomous mechanisms.

Abstract

El cultivo de neuronas del hipocampo primaria in vitro facilita el interrogatorio mecanicista de muchos aspectos del desarrollo neuronal. Disociadas las neuronas del hipocampo embrionarias a menudo pueden crecer con éxito en cubreobjetos de vidrio a alta densidad en condiciones libres de suero, pero los cultivos de baja densidad normalmente requieren un suministro de factores tróficos por ellos co-cultivo con una capa de alimentación glia, la preparación de los cuales puede llevar mucho tiempo y laborioso. Además, la presencia de glia puede confundir la interpretación de los resultados y los estudios se oponen sobre los mecanismos específicos de neuronas. A continuación, se presenta un método simplificado de ultra-baja densidad (~ 2.000 neuronas / ^cm2), a largo plazo (> 3 meses) la cultura de las neuronas del hipocampo primaria que se encuentra bajo condiciones libres de suero y sin apoyo de células glia. neuronas de baja densidad se cultivan en cubreobjetos recubiertos con poli-D-lisina, y se volcó en las neuronas cultivadas de alta densidad en una placa de 24 pocillos. En lugar de utilizar puntos de parafina para crear un espacio between las dos capas neuronales, los experimentadores pueden simplemente grabar el fondo de plástico del pozo, en el que residen las neuronas de alta densidad, para crear un microespacio propicio para el crecimiento de las neuronas de baja densidad. El co-cultivo puede ser mantenido fácilmente durante> 3 meses sin pérdida significativa de neuronas de baja densidad, lo que facilita el estudio morfológico y fisiológico de estas neuronas. Para ilustrar esta condición de cultivo exitoso, se proporcionan los datos para mostrar la formación de sinapsis profusa en las células de baja densidad después del cultivo prolongado. Este sistema de co-cultivo facilita también la supervivencia de las neuronas individuales dispersas cultivadas en islas de sustratos de poli-D-lisina y por lo tanto la formación de conexiones autaptic.

Introduction

Cultivo de neuronas del hipocampo en condiciones in vitro permite la observación y la manipulación experimental de estas neuronas que de otra manera no son posibles en vivo. Este enfoque experimental es ampliamente utilizado para revelar los mecanismos neuronales de crecimiento, la polaridad, la especificación de neuritas, el tráfico y la localización subcelular de las proteínas, la formación de sinapsis y la maduración funcional ^1. Estos in vitro neuronas del hipocampo en cultivo, cuando se cosecha a partir de las últimas etapas embrionarias, son relativamente puro (> 90%) de las células glutamatérgicas de la morfología piramidal ^2. Debido a que las neuronas se cultivaron en una superficie de 2-D en condiciones in vitro, este método permite la observación fácil, tales como formación de imágenes en vivo o inmunocitoquímica (ICC) tinción a través de un único plano focal ^3; o manipulaciones, como el tratamiento de drogas y transfecciones ^3-6. Cuando se cultiva a alta densidad, las neuronas tienden a tener altas tasas de supervivencia a causa de una mayor cooperaciónncentrations de factores de crecimiento secretados además de apoyo alimentario a partir de los medios de crecimiento, y también debido a los mecanismos dependientes del contacto neuritas ^7. Sin embargo, las neuronas del hipocampo de baja densidad son deseables para los estudios morfológicos, donde una neurona individual se pueden obtener imágenes en su totalidad o teñido para el análisis de la CPI. Neuronas de baja densidad son difíciles de mantener en cultivo debido a la falta de apoyo paracrina y por lo tanto a menudo requieren soporte trófico de un glial (típicamente cortical astrocitos) capa de alimentación, que tiene que ser preparada antes del cultivo de las neuronas ^2. Cuando se co-cultivaron con una capa de alimentación de células gliales, las neuronas de baja densidad se cultivan en cubreobjetos, y luego da la vuelta en la parte superior de la capa de células gliales de modo que las neuronas de baja densidad y glia se enfrentan entre sí. Un pequeño espacio confinado entre la glía y las neuronas se crea mediante la colocación de puntos de cera de parafina en las esquinas de los cubreobjetos, por lo tanto la creación de un diseño de "sandwich" ^2,8,9. Las neuronas de baja densidad crecerán wentro del espacio confinado entre glia y el cubreobjetos, que crea un microambiente permisiva con factores concentrados secretadas por las neuronas y células gliales. Este enfoque produce baja densidad, las neuronas plenamente desarrollados que están espaciados aparte razonable, por lo tanto, facilitar el etiquetado de la CPI o estudios de imagen en vivo.

Un inconveniente evidente de co-cultivo neurona-glía, además de ser lento y laborioso, es que evita estudio de específicos de neuronas, o células autónomas, mecanismos. Aunque este sistema es mucho menos complejo que in vivo el tejido neural, células gliales impacto sobre el desarrollo de las neuronas a través de factores definidos, que aún no es totalmente segregadas pueden confundir a los experimentos ^10. Por lo tanto, en los experimentos que requieren la investigación de mecanismos específicos de neuronas, las condiciones de cultivo definidos que eliminar el suero y la capa de apoyo glial son necesarios. Un estudio previo ha tenido éxito en el cultivo de bajas concentraciones de neuronas (~ 9.000 células / cm ²⁾ usando un THmatriz de hidrogel dimensiones ree ^11. Desde una población neuronal relativamente puro puede cultivarse a alta densidad en condiciones libres de suero sin apoyo glial, que postula que ultra-baja densidad de neuronas del hipocampo se puede cultivar en suero libre definido medio de cultivo por los co-cultivo con las neuronas de alta densidad, en de una manera que es análoga a la neurona-glía co-cultivo convencionalmente adoptado. De hecho, la alta densidad de las neuronas del hipocampo culturas en una configuración de "sandwich" se han utilizado recientemente para apoyar a un pequeño número de neuronas magnocelular endocrinas especializadas ^12.

Por lo tanto, co-cultivo con las neuronas de alta densidad puede permitir que las neuronas de baja densidad que reciben apoyo factores tróficos que es suficiente para permitir la supervivencia a largo plazo. Este protocolo de neuronas ultra-baja densidad de cultivo fue así formulado y validado. El protocolo puede implementarse dentro de un único experimento, mediante la preparación de alta densidad (~ 250.000 células / ml) dislas neuronas del hipocampo no asociados primero, y luego hacer una dilución para producir una densidad de ~ 10.000 neuronas / ml (~ 3.000 neuronas / cubreobjetos, o ~ 2.000 neuronas / cm ^2), que es mucho más bajo que la mayoría informó de cultivos de baja densidad ^{2,3,9 , 11,13.} Esta condición se conoce la cultura libremente como cultura "ultra-baja densidad 'y se utiliza con" baja densidad "de manera intercambiable. Las neuronas de alta densidad se colocan en el poli-D-lisina placas de 24 pocillos recubiertas; mientras que las neuronas de baja densidad se siembran en cubreobjetos de vidrio de 12 mm recubiertos con poli-D-lisina que se colocan dentro de otra placa de 24 pocillos. Los cubreobjetos con adherir neuronas de baja densidad se da la vuelta en la parte superior de las neuronas de alta densidad 2 horas más tarde después de que las neuronas se descienden y se unen a los cubreobjetos. Además, en lugar de utilizar puntos de cera de parafina para elevar los cubreobjetos por encima de la capa de neuronas de alta densidad, se utilizó una aguja de jeringa de 18 G para grabar la parte inferior de las placas de 24 pocillos con dos franjas paralelas. El resultado MostrAced, plásticos adyacentes proporcionar un soporte elevado para los cubreobjetos de vidrio. Este espacio se mide constantemente a 150-200 micras, lo que permite suficiente intercambio de oxígeno y medio de cultivo al tiempo que proporciona un microambiente con factores tróficos concentradas. Bajo esta condición, las neuronas de baja densidad crecen mucho, y pueden sobrevivir más allá de tres meses en cultivo. Cuando estas neuronas son transfectadas con el plásmido GFP después de tres semanas de cultivo, las dendritas están profusamente salpicado de espinas dendríticas. Como prueba de principio, los datos se presentan para mostrar que este sistema de co-cultivo apoya culturas ultra-baja densidad de neuronas del hipocampo sembradas en poli-D-lisina 'micro-islas', donde las neuronas forman conexiones autaptic que pueden facilitar la investigación de células , mecanismos independientes de la red -autonomous.

Protocol

Todos los procedimientos experimentales con ratones fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Arizona, y se ajustaban a las directrices del NIH. 1. El tejido del hipocampo Fuente de Neurona Cultura Para generar crías prenatales de ratón para el cultivo de neuronas del hipocampo, utilizar ratones en tiempo de embarazo (C57Bl6 / J) que se crían en la casa 17. Al día con la detección del tapón vaginal se designa c…

Representative Results

El protocolo descrito aquí permite éxito densidad ultra-baja, cultivo a largo plazo de las neuronas glutamatérgicas puro sin la necesidad de células de la glia que actúa como una capa de alimentación. El protocolo se esquematiza en la Figura 1, que implica la preparación de alta densidad (en poli-D-lisina recubierto de 24 pocillos) y las neuronas de baja densidad (en cubreobjetos de vidrio recubiertos con poli-D-lisina) por separado, y la posterior co-cultivo que …

Discussion

Se presenta un protocolo detallado para el cultivo a largo plazo de ultra baja densidad de neuronas glutamatérgicas del hipocampo en condiciones libres de suero. En 2000 ~ neuronas / ^cm2, la densidad es al menos dos veces menor que la mayoría de los preparativos de baja densidad 'de cultivo con o sin el apoyo glía reportado por la literatura existente ^{2,3,11,13,14.} Además de ser ultra-baja densidad, este protocolo es nueva y significativa en dos formas más. En primer lugar, no se necesita …

Materials

Neurobasal medium	Life Technologies	21103-049	Protect from light
B27 supplement	Life Technologies	17504-044	aliquot, store in 0.6ml size
GlutaMAX-I	Life Technologies	35050-061	dilute 100X
antibiotic-antimycotic (AA)	Life Technologies	15240-096	dilute 100X
Complete Culture medium			Neurobasal medium with 1X B27, 1X AA, 1X GlutaMAX-I
Wash medium			same as 'Neurobasal medium'
Feed medium			Neurobasal with 1X B27 supplement
DNAse I	Sigma-Aldrich	D5025	prepare 100X stock at 0.6mg/ml
poly-D-lysine	Sigma-Aldrich	P6407	M.W. 70000-150000
borate buffer	Sigma-Aldrich	B6768 (boric acid); 71997(borax)	1.24g boric acid & 1.9g borax in 400ml H2O, pH to 8.5 use HCl
12-mm round glass coverslips	Glasswarenfabrik Karl Hecht GmbH	1001/12	No. 1 glass, purchase from Carolina Biological Supply
proFection transfection kit	Promega	E1200	see  protocol for details
2X HEPES buffered saline (HBS)	Promega	E1200	see  protocol for details
Syringe filter	Pall Corporation	4192	0.2um pore size
Endofree plasmid prep kit	Qiagen	12362	for preparation of transfection grade plasmid DNA
anti-MAP2 antibody	Millipore	MAB3418	mouse antibody, clone AP20
anti-p-Tau antibody	Millipore	AB10417	rabbit polyclonal antibody
anti-NR1 antibody	Millipore	MAB1586	mouse antibody, clone R1JHL
anti-GluR1 antibody	Millipore	AB1504	rabbit polyclonal antibody
Hank's balanced salt solution	ThermoFisher	14025092	500ml size