Un metodo semplificato per Ultra-Low Density, Long-Term primaria ippocampale Neuron Cultura
Summary
Low density cultures of primary hippocampal neurons usually require glia feeder layer to supply neurotrophic factors and sustain longevity. We describe here a simplified method to culture ultra-low density neurons on glass coverslips in the presence of a high density neuronal feeder layer, which facilitates investigation of specific neuronal-autonomous mechanisms.
Abstract
La coltura neuroni dell'ippocampo primari in vitro facilita interrogatori meccanicistica di molti aspetti dello sviluppo neuronale. Dissociati neuroni dell'ippocampo embrionali possono spesso crescere con successo su vetrini ad alta densità in condizioni di libero-siero, ma le culture a bassa densità in genere richiedono una fornitura di fattori trofici da loro co-coltura con uno strato alimentatore glia, preparazione che può richiedere molto tempo e laborioso. Inoltre, la presenza di cellule gliali può confondere l'interpretazione dei risultati e degli studi ostino sui meccanismi specifici neuroni. Qui, un metodo semplificato è presentato per ultra-bassa densità (~ 2.000 neuroni / cm 2), a lungo termine (> 3 mesi) cultura neurone dell'ippocampo primaria che è in condizioni di libero siero e senza supporto di cellule gliali. neuroni a bassa densità sono coltivate su vetrini rivestiti di poli-D-lisina, e capovolte sui neuroni ad alta densità coltivate in una piastra da 24 pozzetti. Invece di utilizzare punti paraffina per creare uno spazio between i due strati neuronali, gli sperimentatori possono semplicemente incidere il fondo in plastica del pozzo, in cui i neuroni alta densità risiedono, per creare un microspazio favorevole alla crescita neurone bassa densità. Il co-coltura può essere facilmente mantenuta per> 3 mesi senza significativa perdita di neuroni bassa densità, facilitando così lo studio morfologico e fisiologico di questi neuroni. Per illustrare questa condizione culturale di successo, i dati vengono forniti per mostrare la formazione di sinapsi profusa nelle celle a bassa densità dopo la cultura prolungato. Questo sistema di co-coltura facilita anche la sopravvivenza dei neuroni individuali sparse coltivate in isole di substrati poli-D-lisina e quindi la formazione di connessioni autaptic.
Introduction
Crescita neuroni ippocampali in condizioni in vitro consente osservazione e manipolazione sperimentale di questi neuroni che altrimenti non sarebbero possibili in vivo. Questo approccio sperimentale è ampiamente usato per rivelare i meccanismi neuronali della crescita, della polarità, le specifiche dei neuriti, il traffico e localizzazione subcellulare delle proteine, formazione di sinapsi e la maturazione funzionale 1. Questi in vitro in coltura neuroni dell'ippocampo, quando raccolto dalle fasi tardo embrionali, sono relativamente puro (> 90%), le cellule glutamatergiche della morfologia piramidale 2. Poiché i neuroni sono stati coltivati in una superficie 2-D in condizioni in vitro, questo metodo permette una facile osservazione, come ad esempio l'imaging dal vivo o immunocitochimica (ICC) colorazione attraverso un unico piano focale 3; o manipolazioni, come ad esempio il trattamento farmacologico e trasfezioni 3-6. Quando coltivate ad alta densità, i neuroni tendono ad avere alti tassi di sopravvivenza a causa di una maggiore cooperazionencentrations di fattori di crescita secreti in aggiunta al supporto alimentare da parte dei media di crescita, e anche a causa di neuriti meccanismi di contatto-dipendente 7. Tuttavia, a bassa densità neuroni dell'ippocampo sono desiderabili per gli studi morfologici, in cui un singolo neurone può essere ripreso nella sua interezza o tinto per l'analisi ICC. I neuroni a bassa densità sono difficili da mantenere in cultura a causa della mancanza di sostegno paracrino e quindi spesso richiedono il supporto trofico da un gliale (tipicamente corticale astrociti) feeder layer, che deve essere preparato prima la cultura neurone 2. Quando co-coltura con uno strato alimentatore cellule gliali, neuroni bassa densità sono coltivate su vetrini e quindi capovolto sopra dello strato glia in modo che i neuroni e glia bassa densità di fronte all'altra. Un piccolo spazio chiuso tra glia e neuroni viene creato inserendo punti paraffina sugli angoli dei vetrini, creando così un 'sandwich' di layout 2,8,9. I neuroni a bassa densità cresceranno well'ambito lo spazio confinato tra glia e il vetrino, che crea un microambiente permissivo con fattori concentrati secreti dai neuroni e glia. Questo approccio produce a bassa densità, i neuroni completamente sviluppati che sono distanziati ragionevolmente a parte, quindi, facilitando l'etichettatura ICC o studi di imaging dal vivo.
Un inconveniente apparente di neuroni-glia co-coltura, oltre ad essere in termini di tempo e laborioso, è che impedisce lo studio di specifici neuroni, o cellule autonome, meccanismi. Anche se questo sistema è molto meno complessa di in vivo tessuto neurale, impatto glia sullo sviluppo neuronale attraverso secrete, fattori non ancora completamente definiti possono confondere gli esperimenti 10. Pertanto, in esperimenti che richiedono l'indagine dei meccanismi specifici di neuroni, condizioni di coltura definite che rimuovono siero e strato di supporto gliali sono necessari. Un precedente studio è riuscito a coltura basse concentrazioni di neuroni (~ 9.000 cellule / cm 2) utilizzando un esimoree matrice idrogel dimensionale 11. Dal momento che una popolazione neuronale relativamente pura può essere coltivato ad alta densità in condizioni di libero siero senza supporto gliali, ipotizziamo che ultra-bassa densità di neuroni dell'ippocampo può essere coltivata nel siero libera definito terreno di coltura da loro co-coltura con i neuroni ad alta densità, in un modo che è analogo al neurone-glia co-coltura convenzionale adottato. In effetti, ad alta densità di ippocampo culture di neuroni in una configurazione a 'sandwich' sono stati recentemente utilizzati per sostenere un piccolo numero di neuroni endocrini magnocellulari specializzati 12.
Pertanto, la co-coltura con neuroni alta densità possono consentire neuroni bassa densità di ricevere trofico supporto fattori che è sufficiente a consentire la sopravvivenza a lungo termine. Questo protocollo di neuroni ultra-bassa densità di coltura è stata quindi formulata e convalidato. Il protocollo può essere implementato all'interno di un singolo esperimento, preparando ad alta densità (~ 250.000 cellule / ml) DISciato neuroni dell'ippocampo, e poi facendo una diluizione per produrre una densità di ~ 10.000 neuroni / mL (~ 3.000 neuroni / vetrino, o ~ 2.000 neuroni / cm 2), che è molto più basso rispetto alla maggior parte riferito culture a bassa densità 2,3,9 , 11,13. Questa condizione cultura è genericamente indicato come la cultura 'ultra-bassa densita' e utilizzato con 'bassa densità' inter-changeably. I neuroni ad alta densità sono placcati in poli-D-lisina rivestite piastre da 24 pozzetti; mentre i neuroni a bassa densità vengono seminate su vetrini da 12 mm rivestite poli-D-lisina che vengono inseriti all'interno di un altro 24-pozzetti. I vetrini con aderendo neuroni a bassa densità sono capovolte sulla parte superiore dei neuroni ad alta densità di 2 ore più tardi, dopo i neuroni sono discesi e attaccati alle lamelle. Inoltre, invece di utilizzare punti paraffina per elevare i coprioggetti sopra lo strato neurone alta densità, un ago di siringa 18 G è stato usato per incidere il fondo delle piastre da 24 pozzetti con due strisce parallele. La risultante displACED, adiacenti plastiche forniscono un supporto elevato per i coprioggetti di vetro. Questo spazio è costantemente misurato a 150-200 micron, che permette lo scambio di ossigeno e terreno di coltura sufficiente mentre fornisce un microambiente con fattori trofici concentrati. In questa condizione, i neuroni a bassa densità crescere molto, e possono sopravvivere oltre tre mesi in coltura. Quando questi neuroni sono trasfettate con GFP plasmide dopo tre settimane di cultura, i dendriti sono abbondantemente costellate di spine dendritiche. Come prova di principio, i dati vengono presentati per dimostrare che questo sistema di co-coltura supporta culture ultra-bassa densità di neuroni dell'ippocampo seminate su poli-D-lisina 'micro-isole', in cui i neuroni si formano le connessioni autaptic che possono facilitare indagini di cellula , meccanismi indipendenti dalla rete -autonomous.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi presentiamo un protocollo dettagliato per la cultura a lungo termine di ultra-bassa densità di neuroni dell'ippocampo glutamatergici in condizioni di libero siero. A ~ 2000 neuroni / cm 2, la densità è almeno due volte inferiore rispetto maggior parte dei preparati 'basse densita' di cultura, con o senza il supporto glia riportato dalla letteratura esistente 2,3,11,13,14. Oltre ad essere ultra-bassa densità, questo protocollo è nuovo e significativo altri due modi. In primo luog…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by an NIH/NIMH grant to S.Q. (R00MH087628).
Materials
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | Protect from light |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | aliquot, store in 0.6ml size |
| GlutaMAX-I | Life Technologies | 35050-061 | dilute 100X |
| antibiotic-antimycotic (AA) | Life Technologies | 15240-096 | dilute 100X |
| Complete Culture medium | Neurobasal medium with 1X B27, 1X AA, 1X GlutaMAX-I | ||
| Wash medium | same as 'Neurobasal medium' | ||
| Feed medium | Neurobasal with 1X B27 supplement | ||
| DNAse I | Sigma-Aldrich | D5025 | prepare 100X stock at 0.6mg/ml |
| poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | M.W. 70000-150000 |
| borate buffer | Sigma-Aldrich | B6768 (boric acid); 71997(borax) | 1.24g boric acid & 1.9g borax in 400ml H2O, pH to 8.5 use HCl |
| 12-mm round glass coverslips | Glasswarenfabrik Karl Hecht GmbH | 1001/12 | No. 1 glass, purchase from Carolina Biological Supply |
| proFection transfection kit | Promega | E1200 | see protocol for details |
| 2X HEPES buffered saline (HBS) | Promega | E1200 | see protocol for details |
| Syringe filter | Pall Corporation | 4192 | 0.2um pore size |
| Endofree plasmid prep kit | Qiagen | 12362 | for preparation of transfection grade plasmid DNA |
| anti-MAP2 antibody | Millipore | MAB3418 | mouse antibody, clone AP20 |
| anti-p-Tau antibody | Millipore | AB10417 | rabbit polyclonal antibody |
| anti-NR1 antibody | Millipore | MAB1586 | mouse antibody, clone R1JHL |
| anti-GluR1 antibody | Millipore | AB1504 | rabbit polyclonal antibody |
| Hank's balanced salt solution | ThermoFisher | 14025092 | 500ml size |
Referências
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